Jonas Feitosa Lima (2026)
Análise Raman de eritrócitos humanos expostos ao acetato de fenilmercúrio em plataforma opto-acustofluídica
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS-UFAL
INSTITUTO DE FÍSICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FÍSICA
JONAS FEITOSA LIMA
ANÁLISE RAMAN DE ERITRÓCITOS HUMANOS EXPOSTOS AO ACETATO DE
FENILMERCÚRIO EM PLATAFORMA OPTO-ACUSTOFLUÍDICA
MACEIÓ-AL
2026
Jonas Feitosa Lima
Análise Raman de eritrócitos humanos expostos ao acetato de fenilmercúrio em plataforma
opto-acustofluídica
Dissertação apresentada como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em Física ao Programa
de Pós-Graduação em Física da Universidade
Federal de Alagoas - UFAL.
Orientador: Prof. Dr. Uéslen Rocha Silva
Maceió-AL
2026
Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Divisão de Tratamento Técnico
Bibliotecária Myrtes Vieira do Nascimento CRB4/1680
L732a
Lima, Jonas Feitosa.
Análise raman de eritrócitos humanos expostos ao acetato de fenilmercúrio em
plataforma opto-acustofluídica / Jonas Feitosa Lima. – 2026.
88 f. : il. color.
Orientação: Uéslen Rocha Silva.
Dissertação (Mestrado em Física) – Universidade Federal de Alagoas. Instituto de
Física. Programa de Pós-graduação em Física. Maceió, 2026.
Referências: f. 69-74.
Apêndice: f. 75-88.
1. Espectroscopia óptica 2. Células sanguíneas. 3. Biossensoriamento.
4. Eritrócitos. I. Título.
CDU: 535.9:543.42
PARECER DA BANCA EXAMINADORA DE DEFESA DE
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
“Análise Raman de eritrócitos humanos expostos ao acetato de
fenilmercúrio em plataforma opto-acustofluídica”
por
Jonas Feitosa Lima
A Banca Examinadora composta pelos professores Uéslen Rocha Silva, como presidente
da banca examinadora e orientador, do Instituto de Física da Universidade Federal de Alagoas;
Harrisson David Assis Santos, do Instituto de Física da Universidade Federal de Alagoas; e
Andressa Novatski, da Universidade Estadual de Ponta Grossa, consideram o candidato
aprovado.
Maceió, 26 de março de 2026.
Prof. Dr. Uéslen Rocha Silva
Prof. Dr. Harrisson David Assis Santos
Profª. Drª. Andressa Novatski
Dedico essa dissertação aos meus pais Ivan e
Joseane, minha namorada e futura esposa Maria
e em homenagem a meus avós falecidos: voinho
Joel, vovô Manoel e vovó Eulália por todo amor
e carinho.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me ajudar a ter forças para continuar os estudos ao longo desses
dois anos de mestrado, onde muitas dificuldades surgiram no caminho. Sou grato por tudo que
Ele me proporcionou em toda a minha trajetória de vida.
A minha família pelo apoio que sempre me deram: meus pais Ivan e Joseane; meu irmão
Jamerson; minha vó Natildes, minha namorada Maria Aparecida que tanto me incentivaram a buscar meus objetivos, sem eles não estaria onde estou, sou muito grato pelas pessoas maravilhosas
em minha vida.
A todos os meus amigos e colegas que me ajudaram nos dias em Maceió no Instituto
de Física, pelos conselhos, conversas e resenhas. Meu muito obrigado por tudo, em especial ao
Jadielson, João e Valter pela companhia e apoio.
Ao meu orientador Doutor Uéslen Rocha, pela proposta de pesquisa e pelos conselhos e
orientações ao longo de todo mestrado que contribuíram para minha formação acadêmica. Ao
Flávio pelas dicas, ensinamentos em laboratório, e principalmente pela paciência que teve em
me ajudar nos momentos de dúvidas e sempre estar disponível. Agradeço também a Professora
Doutora Ana Catarina, a Sheila e todos os integrantes do Laboratório de Bioenergética (LaBio)
da UFAL pela parceria no projeto e por possibilitar a coletar e preparação das amostras de
eritrócitos para o uso do Raman. Também sou grato pela Jennifer que contribui na execução da
análise multivariada LDA.
A banca examinadora por aceitar o convite e contribuir no trabalho, e consequentemente,
na minha formação acadêmica. Muito obrigado pelas correções e contribuições na dissertação.
Aos professores do Instituto pelos ensinamentos que compartilharam, meu muito obrigado. Aos motoristas dos ônibus da Barra de São Miguel que me auxiliaram nos trajetos para
Maceió, meus agradecimentos por terem contribuído para essa conquista.
Agradeço ao Grupo de Nano-Fotônica e Imagens pelo uso do Microscópio LabRAM
HR Evolution (HORIBA), adquirido por meio de projeto instituiconal com financiamento da
FINEP (Financiadora de Estudos e Projetos), projeto INFRAPESQ-12, para obtenção de partes
dos resultados apresentados. E aos colegas de laboratório pelas dicas e aprendizados, meu muito
obrigado.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas (FAPEAL) pelo apoio financeiro da bolsa ao longo do mestrado, fator decisivo para a realização de todas as atividades,
principalmente a pesquisa.
Que ninguém se engane, só se consegue a
simplicidade através de muito trabalho.
Clarice Lispector
RESUMO
Neste trabalho, investigamos alterações estruturais celulares em eritrócitos humanos expostos ao
acetato de fenilmercúrio (FM), um composto organomercurial amplamente utilizado no passado
como fungicida, conservante e pesticida, conhecido por apresentar potencial toxicidade biológica.
Para isso, foi empregada uma plataforma opto-acustofluídica capaz de realizar o aprisionamento
e a manipulação de células por meio de ondas acústicas estacionárias, permitindo a aquisição de
espectros Raman de forma não invasiva e sem o uso de substratos para fixação celular. Os espectros Raman foram obtidos utilizando excitação laser de 532 nm em eritrócitos saudáveis e em
eritrócitos expostos ao FM. Dois protocolos experimentais distintos foram avaliados: no primeiro,
a incubação das células com o composto foi realizada externamente ao dispositivo acustofluídico;
no segundo, a exposição ocorreu diretamente no interior da microcavidade do dispositivo. Os
resultados indicaram alterações estruturais nos eritrócitos associadas à presença do composto,
evidenciadas por modificações nas bandas espectrais relacionadas à hemoglobina e pela redução
da capacidade de captação de oxigênio das células. Para a análise dos dados espectroscópicos,
foram aplicadas técnicas de análise multivariada, incluindo Análise de Componentes Principais
(PCA) e Análise Discriminante Linear (LDA), que permitiram diferenciar de forma eficiente os
grupos controle e contaminados. O protocolo de incubação externa apresentou maior separação
estatística entre os grupos, indicando maior sensibilidade na detecção das alterações induzidas
pelo fenilmercúrio. Os resultados demonstram o potencial da plataforma opto-acustofluídica
combinada com espectroscopia Raman como uma ferramenta de biossensoriamento capaz de
monitorar alterações bioquímicas em células vivas de maneira rápida, não invasiva e livre de
marcadores. Essa abordagem apresenta aplicações promissoras em estudos de toxicologia celular,
diagnóstico biomédico e monitoramento de efeitos de contaminantes ambientais em sistemas
biológicos.
Palavras-chave: Espectroscopia Raman. Acustofluídica. Eritrócitos. Fenilmercúrio. Biossensoriamento.
ABSTRACT
In this work, we investigated cellular structural alterations in human erythrocytes exposed
to phenylmercury acetate (FM), an organomercurial compound widely used in the past as a
fungicide, preservative, and pesticide, known for its potential biological toxicity. To this end, an
opto-acoustofluidic platform capable of trapping and manipulating cells using standing acoustic
waves was employed, allowing for the non-invasive acquisition of Raman spectra without the
use of substrates for cell fixation. Raman spectra were obtained using 532 nm laser excitation in
healthy erythrocytes and in erythrocytes exposed to FM. Two distinct experimental protocols
were evaluated: in the first, cell incubation with the compound was performed externally to the
acoustofluidic device; in the second, exposure occurred directly inside the microcavity of the
device. The results indicated structural alterations in erythrocytes associated with the presence
of the compound, evidenced by modifications in spectral bands related to hemoglobin and
by a reduction in the cells’ oxygen uptake capacity. For the analysis of spectroscopic data,
multivariate analysis techniques were applied, including Principal Component Analysis (PCA)
and Linear Discriminant Analysis (LDA), which allowed for efficient differentiation between
control and contaminated groups. The external incubation protocol showed greater statistical
separation between the groups, indicating greater sensitivity in detecting the alterations induced
by phenylmercury. The results demonstrate the potential of the opto-acoustic fluidic platform
combined with Raman spectroscopy as a biosensing tool capable of monitoring biochemical
alterations in living cells in a fast, non-invasive, and marker-free manner. This approach presents
promising applications in cellular toxicology studies, biomedical diagnostics, and monitoring
the effects of environmental contaminants on biological systems.
Keywords: Raman spectroscopy. Acoustofluidics. Erythrocytes. Phenylmercury. Biosensing.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Efeitos de um laser incidindo em uma molécula. . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 2 – Diagrama de níveis energéticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 3 – Exemplo de espectro onde os picos em verde são devido ao espalhamento
Raman anti-Stokes, os vermelhos do Stokes e o pico central em preto o
espalhamento Rayleigh. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 4 – Espectro Raman de micropartículas de PS sob excitação óptica do laser de
532 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 5 – (a) Dispositivo acustofluídico e a (b) levitação e aglomeração de células
vermelhas no plano focal do laser Raman na microcavidade cilíndrica, onde
os pontos tracejados representam ondas estacionárias acústicas na direção
axial e o faixe laser em verde proveniente da lente objetiva quando acoplado.
Figura 6 – A força e o torque de radiação acústica de uma onda estacionária (linha
azul tracejada) interferindo sobre um Ery, com orientação determinada pelo
vetor unitário ep (α, β). Quando o dispositivo é ligado (lado direito), o Ery
é impulsionado em direção ao plano nodal a uma certa altura pela ação da
força de radiação acústica e então é alinhado perpendicularmente ao feixe de
luz devido o torque de radiação acústica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 7 – Ilustração da estrutura da hemoglobina em eritrócitos com destaque o anel
porfirínico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 8 – Gráfico das duas principais componentes do exemplo das frutas para PCA. .
Figura 9 – Alguns dados dos grãos analisados para exemplo LDA. . . . . . . . . . . .
Figura 10 – Gráfico com os dados originais à esquerda e separação pela LDA à direita. .
Figura 11 – Classificação LDA dos grão de trigo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 12 – Configuração experimental do sistema opto-acustofluídico constituído de
uma gerador de funções, um osciloscópio, um dispositivo acustofluídico
acoplado ao LabRam HR Evolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 13 – Representação de um corte seccional da geometria de distribuição dos materiais utilizados na confecção do dispositivo de acustofluídica. . . . . . . . .
Figura 14 – Separação do sangue para o grupo controle, onde foram tirados de 6 voluntários saudáveis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 15 – Aprisionamento de Erys (controle) na objetiva de 10X (a) e 40X (b) . . . . .
Figura 16 – Esquema de preparação dos dois métodos utilizados: no FM1 é feito a incubação dos Erys com FM de forma externa e no FM2 ocorre no interior do
achip. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 17 – Espectro Raman médio de 46 Erys do grupo controle. . . . . . . . . . . . .
Figura 18 – Espectros Raman médios dos grupos controle (em preto) e FM1 (vermelho)
(a), na inserção temos o laser Raman focalizado em uma Ery e a diferença
dos espectros médios em (b). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
21
21
22
29
32
35
40
44
44
45
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47
48
48
49
52
53
Figura 19 – Espectros Raman médios dos grupos controle (em preto) e FM2 (vermelho)
(a), na inserção está o laser Raman focalizado, e em uma Ery e a diferença
dos espectros médios em (b). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 20 – Análise PCA dos grupos controle e FM1 (a), Loadings do gráficos PC1 (b) e
para PC2 do conjunto (c). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 21 – Análise PCA dos grupos controle e FM2 (a), Loadings do gráficos PC1 (b) e
para PC2 do conjunto (c). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 22 – Análise PCA dos grupos controle, FM1 e FM2 (a), gráfico que explica quanta
variância é representada por cada fator e inserido nele temos o gráfico da
2º derivada, mostrando o ponto de inflexão, onde determina o limite de
componentes necessárias para representar o sistema (b). . . . . . . . . . . .
Figura 23 – Gráficos dos pontos LDA para os três grupos (a), Loadings do LD1 (b) e LD2
(c) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 24 – Matriz de confusão LDA para os três grupos . . . . . . . . . . . . . . . . .
Figura 25 – Captação de oxigênio entre o grupo controle e com FM (A). Quantificação
da capacidade máxima de captação de oxigênio em 10 s (B). . . . . . . . .
55
57
58
59
60
61
64
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Exemplo com Frutas e algumas características para PCA. . . . . . . . . . .
Tabela 2 – Posições de bandas Raman, mudanças de intensidades em relação ao controle
indicando aumento (seta para cima) ou diminuição (seta para baixo) da
intensidade, coordenada local e componentes celulares dos Erys controle e
FM1 sob excitação de 532 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tabela 3 – Posições de bandas Raman, mudanças de intensidades em relação ao controle
indicando aumento (seta para cima) ou diminuição (seta para baixo) da
intensidade, coordenada local e componentes celulares dos Erys controle e
FM2 sob excitação de 532 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tabela 4 – Resumo das razões espectrais calculadas para os três grupos, onde utilizamos
o EPM como a margem de erro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
54
56
66
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
EPM
Erro padrão da média
Erys
Eritrócitos
FM
Acetato de Fenilmercúrio
GAFM
Grupo de Acústica Física & Microfluídica
GNFI
Grupo de Nano-Fotônica e Imagens
GON
Grupo de Óptica e Nanoscopia
Hb
Hemoglobina
IQB
Instituto de Química e Biotecnologia
LaBio
Laboratório de Bioenergética
LDA
Análise Discriminante Linear
LOC
Lab-on-a-chip
PBS
Solução Salina Tamponada com Fosfato
PCA
Análise dos componentes principais
PS
Poliestireno
PZT
Zirconato de Chumbo e Titânio
UFAL
Universidade Federal de Alagoas
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
2
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
2.1
Fundamentos da espectroscopia Raman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
2.1.1
Interpretação do espalhamento Raman na Mecânica Clássica . . . . . . . .
22
2.1.2
Breve discussão do espalhamento Raman na Mecânica Quântica . . . . . . .
25
2.1.3
Análise da ordem lipídica por espectroscopia Raman . . . . . . . . . . . . .
26
2.2
Introdução à plataforma opto-acustofluídica . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
2.2.1
Força de radiação acústica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
2.3
A importância de se estudar células vermelhas . . . . . . . . . . . . . . . .
33
2.3.1
Estudos com eritrócitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33
2.3.2
O Problema com acetato de fenilmercúrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
2.4
Análise Multivariada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
2.4.1
Análise dos Componentes Principais - PCA . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
2.4.2
Análise Discriminante Linear - LDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
3
METODOLOGIA EXPERIMENTAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
3.1
Descrição da plataforma opto-acustofluídica . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
3.2
Coleta de Erys e separação das amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
3.3
Condições experimentais e aquisição de espectros Raman . . . . . . . . . .
50
4
RESULTADOS E DISCUSSÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51
4.1
Aquisição e análises dos espectros Raman dos eritrócitos . . . . . . . . . .
51
4.2
Análise multivariada dos dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
56
4.2.1
PCA para classificação dos grupos de Erys . . . . . . . . . . . . . . . . . .
57
4.2.2
LDA para classificação dos grupos de Erys . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
4.3
Análise quantitativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
4.3.1
Parâmetro de ordem lipídica da membrana . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
4.3.2
Estado de oxigenação da hemoglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
4.3.3
Parâmetro associado à ligação F e−O2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
64
4.3.4
Parâmetro estrutural do grupo heme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
4.3.5
Comparação entre os grupos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
66
5
CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS . . . . . . . . . . . . . .
68
REFERÊNCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
69
APÊNDICE A – CÓDIGO DO PCA EM PYTHON . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
APÊNDICE B – FORMALISMO QUÂNTICO DO EFEITO RAMAN . . . . . . .
78
APÊNDICE C – INTRODUÇÃO A ACUSTOFLUÍDICA . . . . . . . . . . . . . .
83
C.0.1
Conservação da massa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
83
C.0.2
Conservação do momento linear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
84
C.0.3
Propagação de ondas acústicas em um fluido ideal . . . . . . . . . . . . . .
86
16
1 INTRODUÇÃO
O corpo humano é composto por sistemas complexos e altamente organizados que atuam
de forma integrada para a manutenção da homeostase. Entre esses sistemas, o sangue desempenha papel fundamental, circulando por artérias e veias, e possibilitando o transporte de moléculas
essenciais para o funcionamento celular. Trata-se de um tecido predominantemente líquido,
constituído por proteínas plasmáticas e células especializadas, como leucócitos, plaquetas e
hemácias (eritrócitos). As hemácias têm como principal função o transporte de oxigênio dos
pulmões para os tecidos periféricos e o retorno do dióxido de carbono para eliminação. Em
virtude dessa função central, alterações morfológicas, estruturais ou metabólicas nos eritrócitos
frequentemente constituem indicadores precoces de processos patológicos. Distúrbios envolvendo as hemácias podem decorrer de uma produção anormal de hemoglobina, modificações na
integridade ou permeabilidade da membrana celular, alterações enzimáticas ou ainda disfunções
metabólicas. Além disso, agentes externos, como patógenos e compostos tóxicos, podem comprometer a estrutura e a função dessas células, reduzindo sua capacidade de transportar oxigênio
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013). Nesse contexto, destaca-se a ação de agentes químicos
tóxicos, como os metais pesados, que podem interagir diretamente com componentes celulares e
comprometer a função dos eritrócitos.
O termo “metais pesados” é frequentemente usado nas publicações e nas legislações
referentes aos riscos químicos e ao uso de produtos químicos. Ele se refere a elementos metálicos
e semimetálicos com potencial tóxico, como mercúrio (Hg), cromo (Cr), cádmio (Cd) e arsênio
(As) (DUFFUS, 2001). Dentre eles, o mercúrio é considerado um dos mais tóxicos, em razão
de sua elevada afinidade por grupos sulfidrila presentes na hemoglobina e em outras proteínas
celulares, o que pode provocar alterações conformacionais e estresse oxidativo nos eritrócitos
(NOTARIALE et al., 2022; AHMAD; MAHMOOD, 2019). A contaminação por mercúrio
ocorre tanto por processos naturais quanto por atividades antropogênicas, incluindo a queima de
combustíveis fósseis, práticas industriais e agrícolas e descarte inadequado de resíduos (JAN et
al., 2015). Ele pode ser encontrado no solo, na água e até no ar e possui três formas: mercúrio
elementar, inorgânico e espécies orgânicas. Dentre essas formas, os compostos orgânicos de
mercúrio destacam-se por sua maior biodisponibilidade e toxicidade, o que justifica o crescente
interesse em seus efeitos biológicos.
Compostos orgânicos do mercúrio têm sido usados em diversas aplicações, como por
exemplo, para o combate de infecções de plantas como fungicida, uso medicinal no passado
(como o nitrato de fenilmercúrio usado para desinfetante) que foram substituídos por fármacos
17
mais seguros, dentre outros (LI et al., 2017; BALALI-MOOD et al., 2021). Estudos indicam
que compostos orgânicos, como o metilmercúrio, são responsáveis por alterações neurológicas
tanto no corpo humano quanto em animais, inclusive em exposições pré-natais que sugerem
efeitos generalizados na função cerebral, em especial relacionados a linguagem (AZEVEDO
et al., 2012; GRANDJEAN et al., 1997). Nesse sentido, torna-se relevante investigar outros
compostos organomercuriais, como o acetato de fenilmercúrio, cujos efeitos biológicos ainda
não estão completamente elucidados.
O acetato de fenilmercúrio (FM) é um dos compostos organomercuriais que ainda são
pouco explorados quanto aos seus efeitos em eritrócitos humanos. Estudos prévios demonstraram
que tais compostos podem induzir estresse no DNA e danos estruturais em linfócitos humanos,
sugerindo potencial efeito citotóxico provocado pelo FM (LEE et al., 1997). No entanto, os
impactos específicos sobre hemácias humanas permanecem insuficientemente investigados.
Diante dessa lacuna, é fundamental o emprego de técnicas capazes de investigar, de forma
sensível, eficiente e não invasiva, possíveis alterações estruturais e bioquímicas em eritrócitos
expostos a esses compostos.
Muitas técnicas biomédicas têm sido empregadas na análise de desordens eritrocitárias,
oferecendo suporte diagnóstico e monitoramento de doenças. Entretanto, vários métodos convencionais requerem marcadores químicos, preparo específico de amostras e etapas demoradas
de processamento, o que pode limitar sua aplicação em análises rápidas e não invasivas. Dessa
forma, dispositivos que utilizam a acustofluídica para manipulação celular em microambientes
controlados, quando acoplados à espectroscopia Raman1 têm se consolidado como uma abordagem promissora (SANTOS et al., 2021; ROCHA et al., 2023). A acustofluídica em meios
microfluídicos permite o aprisionamento e a levitação de células vivas através da força de radiação acústica (WU, 1991; SHI et al., 2009), reduzindo interferências do substrato e aumentando
significativamente a razão sinal-ruído das medições espectroscópicas. Essa configuração optoacustofluídica constitui, portanto, uma plataforma de biossensoriamento não invasiva e livre de
marcadores, com elevado potencial para aplicações biomédicas, biotecnológicas e toxicológicas.
Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo geral analisar o estado de saúde
dos eritrócitos humanos expostos ao acetato de fenilmercúrio, utilizando uma configuração
opto-acustofluídica que combina o aprisionamento acústico celular com microscopia Raman
confocal. Como objetivos específicos, pretende-se avaliar as influências desse composto por
meio dos espectros Raman dos eritrócitos, realizando análises qualitativas e quantitativas em
1
Técnica óptica descoberta em 1928 que é baseada no espalhamento inelástico da luz, capaz de fornecer uma
“impressão digital” molecular da amostra.
18
três grupos experimentais: controle, um grupo interagindo com acetato de fenilmercúrio externo
ao dispositivo e outro submetido à exposição dinâmica no interior da microcavidade. Para
interpretação e validação dos resultados entre os grupos, aplicaram-se métodos estatísticos
multivariados, incluindo Análise de Componentes Principais (PCA) e Análise Discriminante
Linear (LDA).
Esta dissertação está estruturada da seguinte forma: o capítulo 1 apresenta o panorama
geral e os objetivos do trabalho (este capítulo); o capítulo 2 aborda a fundamentação teórica da
espectroscopia Raman, da plataforma opto-acustofluídica, da toxicologia em eritrócitos e das
análises multivariadas; o capítulo 3 descreve os procedimentos experimentais; o 4 apresenta e
discute os resultados obtidos; e, por fim, o último capítulo reúne as conclusões e perspectivas
para trabalhos futuros.
19
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
Nesse capítulo abordamos os conceitos relevantes para o nosso trabalho, como os fundamentos da espectroscopia Raman, a plataforma opto-acustofluídica, a importância de estudar
os eritrócitos e fenilmercúrio e as análises multivariadas das Componentes Principais e do
Discriminante Linear.
2.1
FUNDAMENTOS DA ESPECTROSCOPIA RAMAN
A espectroscopia consiste em analisar a interação da radiação eletromagnética com a
matéria, onde seu principal foco é determinar os níveis de energias de átomos ou moléculas.
A partir dos espectros — que indicam as transições energéticas — é possível determinar as
posições relativas dos níveis de energia. Para cada tipo de espectroscopia, existe uma tecnologia
apropiada (SALA, 2008).
Quando uma luz laser interage com a matéria, os fótons que a compõem podem sofrer
parcialmente reflexão ou transmissão, serem absorvidos pelas moléculas ou ainda espalhados
por várias direções, como podemos observar pela Figura 1.
Figura 1 – Efeitos de um laser incidindo em uma molécula.
Fonte: Autor, 2026
O efeito Raman foi inicialmente visualizado por C. V. Raman e K. S. Krishnan em 1928
ao convergirem a luz solar utilizando uma objetiva de telescópio em uma amostra líquida e uma
segunda lente foi posta ao lado da amostra para coleta da radiação dispersada. Através de uma
configuração de filtros ópticos, foi possível detectar a presença de radiação espalhada modificada,
20
ou seja, com frequência distinta referente a luz incidente (RAMAN; KRISHNAN, 1928). Antes
dele, em 1923 Smekal previu teoricamente a dispersão inelástica da luz (SMEKAL, 1923 apud
SMITH; DENT, 2005).
Podemos definir a frequência ν através da equação da velocidade c de uma onda:
ν=
c
,
λ
(1)
onde λ é o comprimento de onda. Além disso, outra grandeza primordial no contexto da
espectroscopia Raman é o número de onda ν̃ definido por:
ν̃ =
ν
,
c
(2)
utilizando a equação (1) em (2), vemos que sua unidade é (cm−1 ):
ν̃ =
ν
1
= ,
c
λ
(3)
esses dois parâmetros são distintos, embora sejam frequentemente permutados (FERRARO et
al., 2003).
Quando uma molécula interage com um determinado campo elétrico, poderá acontecer
uma transferência de energia, ou seja, a diferença de energia entre dois estados quânticos
diferentes ∆E é escrito como:
∆E = hν = h
c
= hcν̃,
λ
(4)
Quando uma luz monocromática incide sobre uma molécula, a pequena parte espalhada
pode ser do tipo Rayleigh, onde estando a molécula no nível fundamental, esta sofre uma colisão
com fóton de energia hν0 e vai para um nível intermediário ou virtual e retorna ao mesmo nível
de início, temos então um espalhamento elástico, uma vez que a energia do fóton espalhado
é idêntica do incidente. Enquanto que no espalhamento Raman Stokes, o fóton espalhado
com energia menor que o incidente decai para um estado vibracional excitado. E por fim, o
espalhamento Raman anti-Stokes acontece quando a molécula já se encontra num estado excitado
e depois da colisão esta cai para o estado fundamental (SALA, 2008). No qual podemos observar
o esquema de níveis energético dos três espalhamentos através da Figura 2
21
Figura 2 – Diagrama de níveis energéticos.
Fonte: Autor, 2025.
Os espectros Raman geralmente são esboçados em termos da intensidade da luz espalhada
em função do deslocamento Raman negativo. Essa convenção torna as componentes Stokes
como positivas e as anti-Stokes negativas, conforme exemplificado na Figura 3 exemplifica.
Figura 3 – Exemplo de espectro onde os picos em verde são devido ao espalhamento Raman antiStokes, os vermelhos do Stokes e o pico central em preto o espalhamento Rayleigh.
Fonte: Autor, 2026.
A maior contribuição de um espalhamento é devido ao tipo Rayleigh que existe quando
a nuvem eletrônica relaxa sem que haja movimento em seu núcleo, por outro lado a dispersão
Raman é um evento muito raro que decorre quando o núcleo sofre movimento ao mesmo tempo
em que a interação entre a luz e os elétrons ocorrem (como veremos adiante), e isso acontece
com uma pequena fração dos fótons espalhados, cerca de 1 em cada 106 a 108 fótons espalhados
(SMITH; DENT, 2005).
22
Como o efeito Raman possui baixa probabilidade de ocorrer, naturalmente a intensidade
de um espectro é baixa na maioria dos casos, uma vez que a radiação excitante tem uma energia
bem menor para acontecer uma transição eletrônica na molécula. No entanto, caso a radiação
excitante estiver numa região de uma banda eletrônica, temos um efeito Raman ressoante, no
qual bandas são intensificadas até na ordem de 105 no espectro (SALA, 2008). Por isso que
escolher um laser apropriado é fundamental para melhorar o sinal Raman.
Um exemplo do uso da espectroscopia Raman é a identificação de materiais orgânicos e
inorgânicos por meio da análise vibracional molecular, como uma impressão digital química.
Durante o mestrado, realizei testes com micropartículas de poliestireno (PS) de 10 µm de
diâmetro para aquisições de espectros Raman, como pode ser observado na Figura 4.
Figura 4 – Espectro Raman de micropartículas de PS sob excitação óptica do laser de 532 nm.
Fonte: Autor, 2025.
Podemos notar que o espectro possui picos bem definidos que são usados para identificar
o material. O maior pico em 1001 cm−1 representa o modo de respiração do anel de benzeno
(C−C) que é a banda mais intensa do espectro de PS; já nos picos 620 cm−1 , 1031 cm−1 e
1602 cm−1 correspondem, respectivamente, à deformação fora do plano do anel (C−C), à
deformação (C−H) no plano e ao estiramento esquelético (C = C) do anel (TAUDUL et al.,
2024; PhysicsOpenLab, 2022). Na próxima seção, iremos abordar os principais elementos do
formalismo clássico para a compreensão do espalhamento Raman.
2.1.1
Interpretação do espalhamento Raman na Mecânica Clássica
Em primeiro lugar, vamos analisar a interação da luz com moléculas e para isso, o
momento de dipolo elétrico p é dado por:
p = αE,
(5)
23
onde α é polarizabilidade atômica e E o campo elétrico incidente. A polarizabilidade é um
tensor que está relacionada com as posições nucleares dos átomos acerca da nuvem eletrônica
(SIDDHANTA et al., 2023).
Considerando que a molécula esteja na presença de um campo elétrico oscilante num
tempo t com frequência ν0 e amplitude E0 , a sua intensidade é:
E = E0 cos (2πν0 t),
(6)
então a intensidade do momento de dipolo será:
p = αE0 cos (2πν0 t).
(7)
Vemos que o dipolo na equação (7) oscila na mesma frequência do campo incidente. Logo,
trata-se de um espalhamento elástico ou como é conhecido, espalhamento Rayleigh. Quando a
molécula possui outros graus de liberdade internos, como vibrações e rotações dos seus núcleos,
em que a polarizabilidade muda periodicamente, então a coordenada do deslocamento do núcleo
q assume o seguinte valor:
q = q0 cos (2πνvib t),
(8)
sendo νvib a frequência de vibração da molécula e q0 a amplitude de vibração.
Para pequenas amplitudes, expandindo em série de Taylor até primeira ordem, temos:
α = α0 +
dα
q,
dq 0
(9)
substituindo as equações (9) e (8) em (7), obteremos:
p = α0 E0 cos (2πν0 t) +
dα
q0 E0 cos (2πν0 t) cos (2πνvib t),
dq 0
(10)
utilizando a seguinte relações trigonométricas:
cos (a ± b) = cos (a) cos (b) ∓ sin (a) sin (b),
(11)
ao somarmos o cosseno da soma de dois arcos com a diferença de arcos de (11), com alguma
manipulação simples, chegaremos:
cos a cos b =
1
[cos(a + b) + cos(a − b)] .
2
(12)
Sejam a = 2πν0 t e b = 2πνvib t em (12), podemos escrever (10) como:
p = α0 E0 cos (2πν0 t) +
1 dα
q0 E0 [cos(2π(ν0 + νvib )t) + cos(2π(ν0 − νvib )t)] ,
2 dq 0
(13)
24
como vimos antes, o primeiro termo da equação (13) está relacionado com espalhamento
Rayleigh, o segundo com o Raman, onde a derivada dα
dq
deve ser diferente de zero para que haja
0
o efeito Raman, ou seja, a mudança da polarizabilidade deve acontecer. Portanto, as frequências
estão associadas da seguinte forma:
ν0 → espalhamento Rayleigh,
(ν0 − νvib ) → Stokes,
(ν0 + νvib ) → Anti-Stokes.
A intensidade da radiação proveniente de um dipolo elétrico harmônico simples é dada
por (LONG, 2002):
I=
π 2 |p|2 ν04 sin2 θ
,
8ϵ0 c30
(14)
agora podemos entender que a intensidade para Raman Stokes IStokes e anti-Stokes Ianti−Stokes
são proporcionais aos termos das frequências a quarta potência de (13), ou seja:
IStokes ∝ (ν0 − νvib )4 ,
4
anti−Stokes ∝ (ν0 + νvib ) .
(15)
I
Em posse das relações em (15), a razão entre as duas intensidades nos leva:
Ianti−Stokes
(ν0 + νvib )4
,
=
IStokes
(ν0 − νvib )4
(16)
percebemos que (16) não leva em conta tudo o que ocorre em laboratório, já que não considera a
temperatura nas aquisições dos espectros Raman por exemplo.
Além disso, o laser utilizado para espectroscopia Raman interfere na qualidade de um bom
espectro. Lasers com comprimentos de onda curtos apresentam uma maior florescência e aquecem
mais a amostra analisada, embora esse tipo de comprimento possibilite mais sensibilidade ao
Raman, devem ser evitados devido ao maior ruído produzido. Já os comprimentos de ondas
longos possuem menos florescência e aquecimento, porém é menos sensível ao efeito Raman,
logo comprimentos de ondas intermediários são ideais como é o caso do laser de 532 nm
(FERRARO et al., 2003).
Essa dependência com o comprimento de onda (ou ainda com a frequência) é evidenciada
pela intensidade Raman da equação (16), pela sua dependência com a quarta potência da
frequência, que como sabemos, é proporcional ao inverso do comprimento de onda como vimos
pela equação (1), portanto quanto mais curto o comprimento de onda, maior a frequência e por
consequência maior a sensibilidade Raman e assim sucessivamente.
A teoria clássica não explica a diferença de intensidade das linhas de dispersão Stokes
e anti-Stokes como mostrado na Figura 3, entretanto, o formalismo quântico nos concede um
25
tratamento quantitativo para a razão de intensidade das linhas Stokes e anti-Stokes (SIDDHANTA
et al., 2023), como veremos a seguir.
2.1.2
Breve discussão do espalhamento Raman na Mecânica Quântica
De forma geral, a razão das intensidades dos espalhamentos Raman é definida pelos
números de ocupação (ou populações) dos estados de referência correspondentes, sendo assim,
o espalhamento Raman Stokes por começar num nível vibracional mais baixo em equilíbrio
termodinâmico, a sua população é sempre maior do que o espalhamento Raman anti-Stokes,
já que ele começa em um nível mais elevado (SIDDHANTA et al., 2023). Para entendermos
melhor, precisamos fazer uso de algumas grandezas fundamentais para se chegar na razão das
intensidades.
Em equilíbrio termodinâmico, a probabilidade de encontrar um nível vibracional de
energia En é descrita pela distribuição de Boltzmann, que no formalismo do ensemble canônico
(SALINAS, 1999):
Pn =
gn e−βEn
,
Z
(17)
onde gn é a degenerescência do nível n, β = kB1T com T a temperatura em Kelvin e Z é a função
partição, que pode ser escrita como:
Z=
X
gn e−βEn .
(18)
n
Além disso, precisamos do número de moléculas no nível vibracional n, ou seja, a
população desse nível que é dada por:
Nn = N Pn ,
(19)
assim, a razão entre as populações dos níveis excitado n e fundamental 0 é:
0)
Nn
gn − (Ekn −E
BT
= e
,
N0
g0
h
i
(20)
vamos considerar que os níveis vibracionais referentes ao espalhamento Raman são baixos
(temperatura do cotidiano), então podemos dizer que cada modo vibracional é descrito como um
oscilador harmônico quântico unidimensional e não degenerado, cujos níveis de energia são:
1
En = ℏωvib n +
,
(21)
2
onde ωvib é a frequência angular vibracional que pode ser escrito em termos do número de onda
ν̃ através da equação (4).
26
Como cada nível vibracional é não degenerado (gn = 1), a razão entre as populações do
primeiro nível de energia excitado (n = 1) e do fundamental (n = 0) será:
hcν̃vib
N1
−
= e kB T ,
N0
h
i
(22)
sendo a intensidade Raman proporcional à população do estado inicial envolvido na transição,
I ∝ Ninicial , e o espalhamento Raman uma transição vibracional, ou seja, o fóton incidente excita
uma molécula para um nível virtual, no qual ela relaxa para outro nível vibracional de energia:
• Raman Stokes: n = 0 → n = 1
• Raman anti-Stokes: n = 1 → n = 0,
portanto, IStokes ∝ N0 e Ianti−Stokes ∝ N1 . A razão entre as intensidades é:
hcν̃vib
Ianti−Stokes
N1
−
=
∝ e kB T .
N0
IStokes
h
i
Considerando tudo o que vimos antes e a parte clássica, temos:
vib
Ianti−Stokes
(ν0 + νvib )4 −hcν̃
kB T
e
,
=
IStokes
(ν0 − νvib )4
(23)
(24)
Por isso que a intensidade Raman anti-Stokes é menor do que a Stokes, uma vez que depende
da população do nível vibracional excitado, que é descrita pela distribuição de Boltzmann e é
exponencialmente pequena em temperatura ambiente como a equação (24) impõe. Mais adiante,
vamos abordar as características essenciais da plataforma opto-acustofluídica.
2.1.3
Análise da ordem lipídica por espectroscopia Raman
A espectroscopia Raman é uma ferramenta que evolui continuadamente, e com ela
podemos investigar a estrutura de biomembranas através de análises quantitativas espectrais
em células. O dano dos lipídios da membrana eritrocitária, por exemplo, pode ser estimado
analisando as bandas Raman entre 1000 e 1300cm−1 . Os picos nessas regiões são associados
à vibração de alongamento do esqueleto C − C, onde são muito sensíveis a alterações na
conformação dos lipídios da membrana (LI et al., 2012).
A banda em torno de 1126cm−1 estão relacionados às vibrações de alongamento trans
e o pico por volta de 1082cm−1 é atribuído às vibrações gauche. A conformação trans está
corresponde a cadeias mais estendidas e organizadas, enquanto a conformação gauche indica
maior desordem estrutural e fluidez da membrana. Nesse contexto, define-se o parâmetro de
27
ordem lipídica Strans , o qual fornece uma medida quantitativa do grau de organização da
bicamada lipídica, sendo expresso por:
Strans =
(I1126 /I1082 )
,
1, 77
(25)
conforme proposto na literatura (LI et al., 2012), essa razão é normalizada pelo fator 1, 77;
correspondente ao valor de referência obtido para cadeias hidrocarbonadas completamente
desordenadas. Dessa maneira, valores mais elevados de Strans indicam maior predominância
da conformação trans, refletindo um aumento na ordem estrutural e na rigidez da membrana,
enquanto valores menores estão associados a um aumento da desordem e da fluidez lipídica.
2.2
INTRODUÇÃO À PLATAFORMA OPTO-ACUSTOFLUÍDICA
Nesse momento vamos discutir uma introdução da plataforma opto-acustofluídica que é
composta pelas técnicas bem estabelecidas: espectroscopia Raman e acustofluídica. Como já
abordamos a parte Raman na seção anterior, a partir de agora vamos apresentar a acustofluídica.
Embora a espectroscopia Raman convencional tenha bons resultados de uma forma geral,
há algumas limitações e desvantagens em sua aplicação. Uma das principais é a baixa intensidade
do sinal retroespalhado pela substância analisada, uma vez que o espalhamento Raman é um
processo muito raro de ocorrer o que resulta em sinais fracos fazendo com que exija maior tempo
de aquisição ou potência do laser, e com uma exposição prolongada ou intensa do laser, pode
causar aquecimento local e danos às células vivas, isso sem mencionar de um possível aumento
do sinal de fluorescência tornando assim, limitante (FERRARO et al., 2003). Outra desvantagem
do uso convencional é o sinal ruído de fundo gerado pela utilização de lâminas de vidro ou
outro material para suporte que podem poluir o sinal do espectro Raman. Ademais, na análise
de células geralmente se utiliza de substratos para fixação celular quando se deseja estabilidade
espacial, o que provoca a morte das amostras, que leve a perda de algumas informações celulares
importantes durante as aquisições (RUSCIANO et al., 2008). Em contrapartida, a análise de
células vivas em meio líquido evita artefatos de fixação, mas introduz novos desafios como
a varredura na solução em busca de uma célula dispersa para realização do espectro. Esse
procedimento se torna exaustivo e pode apresentar baixa eficiência dificultando o monitoramento
repetido da mesma célula.
Por isso, a estratégia pensada é o uso de um (chip) acustofluídico (achip) para vencer
essas dificuldades. Os achips (ou ainda os dispositivos) acustofluídicos são responsáveis por levitar e agregar materiais orgânicos, como células, e inorgânicos (micropartículas) por intermédio
28
da força de radiação acústica que surge através das ondas estacionárias. Essa força tem dependência das propriedades mecânicas do fluído presente na microcâmera e dos micromateriais,
diferentemente de outras tipos de levitações, a acustofluídica engloba vários materiais além de
ser compacta e versátil podendo ser acoplada a vários sistemas (BRUUS, 2012b). Esse tipo de
tecnologia que utiliza a microfluídica — no qual é uma ciência que lida com a manipulação de
pequenas quantidades de fluidos confinados em canais transversais na dimensão de micrômetros — permite a investigação de uma célula isolada ou ainda de um aglomerado aprisionado
acusticamente em um cavidade a nível de volume em microlitros. Os dispositivos utilizam o
conceito lab-on-a-chip (LOC), no qual funções de um laboratório analítico são implantadas
em um achip de escala reduzida na ordem de centímetros. As vantagens deste tipo de sistema
LOC que se sobressai dos convencionais são muitas, como é o caso do pouco volume necessário
para experimentação, o que diminui ou até evita o desperdício e o investimento dos compostos
usados; e o uso do tempo reduzido tornando mais eficiente a análise, dentro outras vantagens
(DENG et al., 2020). Na literatura, muitos avanços aconteceram nessa área, estudos com Erys,
micropartículas de plásticos, células biológicas, ovos de sapo, entre outras (ROCHA et al., 2023;
SANTOS et al., 2021; WU, 1991).
O dispositivo acustofluídico é construído por inteiro via impressão em 3D e possui uma
microcavidade que ao ser preenchido com um fluido através de um dos dois microcanais, e
inserido logo em sequência micropartículas ou células é capaz de produzir ondas ultrassônicas
que se propagam no fluido do recipiente, onde em sua base possui um piezoelétrico que converte
energia elétrica em mecânica quando o equipamento é ligado. Surge então a força de radiação
acústica de primeira ordem (F(1)
ac ) que provoca a levitação destas partículas num plano nodal
e conforme elas se aproximam, uma outra interação aparece, a força de radiação acústica de
(2)
segunda ordem (Fint ) que promovem agregação de células nos nós de pressão, formando um
aprisionamento, como a Figura 5 exemplifica.
29
Figura 5 – (a) Dispositivo acustofluídico e a (b) levitação e aglomeração de células vermelhas no
plano focal do laser Raman na microcavidade cilíndrica, onde os pontos tracejados
representam ondas estacionárias acústicas na direção axial e o faixe laser em verde
proveniente da lente objetiva quando acoplado.
Fonte: Autor, 2026.
As técnicas de manipulações sem contato, como a levitação acústica, são de importância
ímpar para o desenvolvimento da ciência como um todo, seja em análises de células para estudos
de interações, compostos químicos para produção de fármacos, desenvolvimento de nanotecnologias dentre outras. Quando a tecnologia do achip é acoplada ao sistema de espectroscopia
Raman para detecção em tempo real de alterações bioquímicas celulares, temos uma plataforma
multifuncional que além de amplificar o sinal Raman ainda permite tomar espectros de células
sem uso de substrato para fixá-las, pois o agregado formado torna estável e reproduz o ambiente
fisiológico das células sem qualquer dano e ainda possibilita um menor tempo de aquisição e miniminiza o ruído de fundo devido a levitação próxima ao centro da cavidade (RUEDAS-RAMA
et al., 2007; SANTOS et al., 2021). Na seção seguinte, vamos aprofundar as forças de radiação
acústicas que surgem na microcavidade.
2.2.1
Força de radiação acústica
Conforme discutido anteriormente, o fenômeno acústico por trás do movimento de
partículas suspensas em um fluido no interior do achip é causado pelas forças de radiação
acústica (tanto primaria quanto secundária), no qual ocorre devido ao momento transferido de
uma onda ultrassônica incidente sobre partículas imersas em um fluido (BRUUS, 2007).
A interação proveniente da força de radiação acústica com células ou micropartículas tem
como resultado uma mudança do fluxo de momento linear de uma onda incidente no decorrer do
30
espalhamento. Vamos assumir que o raio das micropartículas b é muito menor que o comprimento
de onda acústico λac (r ≪ λac ). Para esse caso, no limite de espalhamento de Rayleigh, podemos
definir a força de radiação acústica F(1)
ac de primeira ordem dentro de uma microcâmera como
sendo menos o gradiente de uma função potencial Uac (BRUUS, 2012b; SANTOS et al., 2021):
F(1)
ac = −∇Uac ,
(26)
cuja potencial acústico Uac é:
4πb3
Uac =
3
f1
3f2
2
2
κ0 |pca | −
ρ0 |vca | ,
2
4
(27)
onde os coeficientes f1 e f2 estão relacionados com compressibilidade e fatores de contraste de
densidade entre a partícula e o líquido circundante, respectivamente. Temos a compressibilidade
adiabática κ0 , ρ0 é a densidade de massa, pca a pressão acústica e vca a velocidade do fluido na
microcâmera.
(2)
A força de radiação secundária Fint ocorre quando duas ou mais micropartículas estão
próximas uma das outras no plano nodal devido ao re-espalhamento dos campos acústicos por
meio da superfície das amostras. Vamos assumir duas células iguais: eritrócito 1 e 2, aprisionadas
num campo de pressão onde estão a uma distância d uma da outra. Se considerarmos que o
eritrócito 1 provoca o espalhamento da onda incidente, a força de radiação secundária, ou de
interação, acústica sentida pelo eritrócito 2 é dada por (SILVA; BRUUS, 2014):
(2)
Fint = −∇⊥ Uint ,
(28)
o operador ∇⊥ representa o gradiente transversal. Podemos expressar o potencial de interação
Uint como:
∗
Uint = −πb3 f2 ρ0 RE[vca
· ves ],
(29)
o termo ves está associado a velocidade do fluido do espalhamento acústico e RE é a parte real.
Essa força de interação possui ordem de grandeza muito menor que a primária (26), uma vez que,
exige densidades de micropartículas muito grandes e por isso, possibilita aplicações diversas
em agregados, no qual as células estão nos nós de pressão devido a força primária (LAURELL
et al., 2007). Pode-se notar que a equação (29) nos mostra que a sua intensidade depende do
tamanho da célula, no entanto, a posição de aprisionamento, consequentemente os pontos de
mínimos do potencial acústico, possui dependência somente dos campos de pressão e velocidade
do interior da microcavidade, isso pode ser facilmente observado ao tomar o gradiente de Uint .
Vale salientar a restrição de que o volume das células aprisionadas deve ser muito menor que o
da cavidade.
31
Considerando que a força de interação tem papel de força central no plano de levitação,
ou seja, dependerá da distância dos eritrócitos, com isso, podemos aproximar a velocidade da
onda espalhada como (PIERCE, 2019):
ves ∼
b3 f2 vca
,
r3
(30)
onde r é a distância do centro da partícula 2 até o ponto de referência. Já o potencial de interação:
Uint ∼
−πb6 f22 ρ0 |vca |2
.
r3
(31)
Portanto, a força de interação acústica se aproxima de
(2)
Fint ∼ |∇⊥ Uint |r=d ∼
πb6 f22 ρ0 |vca |2
,
d4
(32)
no qual usamos ∇⊥ |vca |2 ∼ |vca |2 /Rca , com Rca sendo o raio da microcavidade (SANTOS et al.,
2021). Antes de compararmos as forças, primeiro iremos escrever a força de radiação primária
aproximada, ao estimamos que a principal contribuição do potencial acústico é proporcional aos
termos do fator f2 que se relaciona com a velocidade do fluído, então:
Uac ∼ πb3 ρ0 |vca |2 f2 ,
(33)
enquanto que a força de primeira ordem se aproxima:
(1)
Fac
∼
πb3 ρ0 |vca |2 f2
.
Rca
(34)
Logo, a razão entre as intensidades das forças (32) e (34) será:
(2)
Fint
∼
(1)
Fac
b3 f2 Rca
,
d4
(35)
podemos constatar que essa razão estando elevada à quarta potência no denominador, a força de
interação cai absurdamente rápido quando as células se afastam, no inverso, quando elas estão
muito próximas a força dominante passa a ser a de interação, formando cadeias estáveis num
estilo "colmeia".
Um exemplo prático, ao consideramos os dois eritrócitos na água, com raio aproximado
de b ∼ 3, 75 µm, com distância entre elas de d = 2b (contato iminente), Rca = 1, 8 mm e
f2 ∼ 0, 06, teremos que fração é algo em torno de 1, 8. Esse valor, superior à unidade, indica
que as forças intercelulares superam a radiação primária, promovendo a auto-organização dos
eritrócitos em agregados estáveis, uma vez que a força de interação cresce de forma abrupta
conforme a distância entre os eritrócitos diminui.
32
Quando o achip é ligado, além das forças, também temos o torque de radiação acústica,
no qual este exerce o papel de alinhamento das Erys paralelamente ao plano nodal, onde isso
gera uma configuração que minimiza sua energia potencial (Leão Neto et al., 2021), conforme a
Figura 6 ilustra.
Figura 6 – A força e o torque de radiação acústica de uma onda estacionária (linha azul tracejada)
interferindo sobre um Ery, com orientação determinada pelo vetor unitário ep (α, β).
Quando o dispositivo é ligado (lado direito), o Ery é impulsionado em direção ao
plano nodal a uma certa altura pela ação da força de radiação acústica e então é
alinhado perpendicularmente ao feixe de luz devido o torque de radiação acústica.
Fonte: Adaptado de (ROCHA et al., 2023).
Além da força e torque de radiação acústica responsáveis pelo aprisionamento e alinhamento das células, a atenuação da onda ultrassônica no fluido pode gerar microescoamentos
acústicos (acoustic streaming), produzindo forças de arraste que induzem deslocamentos no
plano de levitação (WIKLUND et al., 2012). Esse efeito pode comprometer a estabilidade
necessária para a aquisição do espectro Raman. Estratégias como a otimização geométrica das
microcavidades e o ajuste das condições de confinamento como a potência utilizada, têm sido
empregadas para minimizar o microescoamento e aumentar a eficiência do aprisionamento como
foi o caso do achip usado por este trabalho (BACH; BRUUS, 2020).
Vale mencionar também que, em frequências na faixa de MHz como empregado no
dispositivo acustofluídico utilizado, o ultrassom é amplamente aplicado em microfluídica devido
à compatibilidade entre o comprimento de onda acústico e as dimensões submilimétricas dos
microcanais, permitindo a formação de ondas estacionárias de pressão (modos de ressonância)
(BRUUS, 2012a). Esses campos são usualmente gerados por transdutores piezoelétricos excitados
por tensão alternada, que produzem oscilações harmônicas de pressão no interior do ressonador
33
(BARNKOB, 2009). Sob condição de ressonância, ocorre máxima transferência de energia
acústica ao sistema, resultando em forças de radiação mais intensas, estáveis e reprodutíveis
sobre as células suspensas (Gorkov, 1962; BRUUS, 2012a). Posteriormente, será tratado os
estudos com Erys e a importância de se estudá-las, em especial, quando expostas ao FM.
2.3
A IMPORTÂNCIA DE SE ESTUDAR CÉLULAS VERMELHAS
Nesta seção vamos abordar as características das Erys e a importância de estudá-la, mais
especificamente quando expostas a agentes tóxicos como o fenilmercúrio.
2.3.1
Estudos com eritrócitos
O sangue é um composto fundamental para os seres humanos, um tecido conjuntivo que
se encontra na forma fluida. Ele é formado por uma parte sólida, contendo células vermelhas
(também conhecidas como glóbulos vermelhos ou eritrócitos), plaquetas e os glóbulos brancos
ou leucócitos, e outra parte fluida de cor amarela, conhecida como plasma (WOEHL; WOEHL,
2016).Na medicina laboratorial, o sangue representa um dos principais meios diagnósticos, pois
reflete alterações metabólicas, infecciosas, inflamatórias e hematológicas sistêmicas. Doenças
como a infecção pelo HIV, hepatites virais, disfunções hepáticas e insuficiência renal podem ser
diagnosticadas ou monitoradas por meio de análises sanguíneas. Especificamente em relação aos
eritrócitos, alterações estruturais e bioquímicas permitem a investigação de diversas condições
clínicas, como anemias, doença falciforme, diabetes, malária e intoxicação por metais pesados,
uma vez que essas patologias afetam diretamente a morfologia celular, a estrutura da hemoglobina
ou o estado oxidativo da célula (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013; NOTARIALE et al., 2022).
Do ponto de vista fisiológico, cada componente sanguíneo desempenha funções específicas que justificam sua importância diagnóstica. Os leucócitos são responsáveis pela defesa
imunológica do corpo, ao combater infecções; os eritrócitos possibilitam o transporte de oxigênio
para os tecidos do corpo que ao serem transformados em energia, há a liberação de dióxido
de carbono que é transportado pelos glóbulos vermelhos aos pulmões; e o plasma participa
do transporte de nutrientes, hormônios, metabólicos e outras substâncias, distribuindo pelo
organismo (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013).
Dentre esses componentes, os eritrócitos assumem papel central tanto fisiológico quanto
diagnóstico, o que justifica uma descrição mais detalhada de suas características estruturais e
moleculares. Os Erys apresentam formato de um disco bicôncavo de coloração rósea e sem
núcleo, medindo aproximadamente 7.5–8 µm de diâmetro e uma sobrevida de cerca de 120 dias.
34
A sua principal função, das trocas gasosas entre oxigênio e gás carbônico, é devido a hemoglobina
(Hb), uma proteína essencial para o funcionamento dos Erys (HOFFBRAND; MOSS, 2017). Em
suma, a molécula de Hb é formada por quatro subunidades proteicas globulares: duas cadeias
alfa e duas cadeias beta, onde cada cadeia proteica está ligada ao heme (o grupo prostético) que
abriga em seu centro um átomo de ferro que pode ser ligado momentaneamente ao oxigênio
(RUSCIANO et al., 2008).
Estudos que utilizam a espectroscopia Raman para avaliar eritrócitos vivos frequentemente empregam suportes de vidro ou silício, no qual os Erys são gotejados em soluções
fisiológicas onde é aguardado um tempo longo de espera, algo em torno de uma hora para coagulação das células. Posteriormente, a aquisição do espectro Raman perde intensidade devido ao
baixo sinal retroespalhado. Tais protocolos são essenciais para manter a viabilidade celular e criar
condições propícias à aquisição espectral; porém, esses procedimentos podem ser trabalhosos e
apresentar desafios, como a redução da razão sinal-ruído ou a interferência do meio circundante
no sinal Raman, sem contar o tempo gasto para preparação (KANG et al., 2008; BRAZHE et al.,
2009).
Nesse contexto, surge uma solução através do uso da microfluídica, que vem com um
crescente uso na manipulação de micro/nanopartículas e células num ambiente controlado,
para inclusive utilizar junto à espectroscopia Raman. Com uso de dispositivos que manipulem
pequenas partículas, como por exemplo células de algas vivas, ao utilizar ondas de ultrassom
para levitá-las, permitem aumentar o sinal Raman sem utilizar qualquer interferência externa
como contrastes, simulando assim um ambiente real (WOOD et al., 2005). Esse tipo de método
de acoplamento, permite investigar a estrutura molecular de células, tornando-se uma ferramenta
de diagnóstico e monitoramento para volumes mínimos de amostras, na ordem de microlítros de
células animais vivas, como por exemplo, detectar infecções celulares como a malária (PUSKAR
et al., 2007).
De maneira mais específica, em Erys, os espectros Raman adquiridos de uma única célula
tem como maior contribuição a Hb, cujo perfil espectral é muito sensível a alterações estruturais
e ao estado funcional da proteína. A Hb é uma proteína tetramérica composta por duas cadeias α
e duas β (em adultos), cada uma associada a um grupo heme. Este grupo prostético contém um
anel de porfirina com um átomo de ferro central, responsável pela ligação reversível ao oxigênio,
conforme ilustrado na Figura 7.
35
Figura 7 – Ilustração da estrutura da hemoglobina em eritrócitos com destaque o anel porfirínico
Fonte: Autor, 2026.
Quando nos referimos do ponto de vista espectroscópico, as bandas Raman mais intensas
estão associadas principalmente às vibrações do anel porfirínico do heme, e não diretamente à
estrutura quaternária da proteína como um todo. Isso acontece devido a geometria do anel de
porfirina ser aproximadamente planar e possuir um sistema de elétrons π deslocalizados, tornando
sua nuvem eletrônica com elevado possibilidade de deformação, ou seja, elevada polarizabilidade
eletrônica (WOOD; MCNAUGHTON, 2002). Com isso, favorece fortemente o espalhamento
Raman, especialmente sob condições de ressonância (Raman ressonante), quando o comprimento
de onda do laser coincide com bandas de absorção eletrônica do heme. Dessa forma, torna-se
possível identificar mudanças conformacionais da proteína sob diferentes condições fisiológicas
e patológicas, incluindo a exposição a metais pesados (KANG et al., 2008).
Estudos recentes têm demonstrado, por exemplo, danos estruturais causados na Hb e nos
lipídios dos eritrócitos após a exposição ao timerosal, um composto orgânico do mercúrio. Além
disso, alterações conformacionais na hemoglobina também foram investigadas em pacientes com
a doença do coronavírus 2019 (COVID-19) através do uso da espectroscopia Raman, evidenciando a sensibilidade da técnica a mudanças estruturais em diversos contextos patológicos e
toxicológicos (SALES et al., 2022; SALES et al., 2023). Diante desses achados, torna-se relevante expandir essa abordagem para investigar os efeitos de outros compostos organomercuriais,
como o acetato de fenilmercúrio, temática que será abordada na seção subsequente.
36
2.3.2
O Problema com acetato de fenilmercúrio
O acetato de fenilmercúrio (FM) é um composto orgânico do mercúrio, caraterizado como
um pó cristalino branco, ou pequenos prismas ou folhetos brancos, inodoro, tóxico ao ingerir
ou inalar ou ainda absorção cutânea; utilizado como herbicida e fungicida, sendo misturado
com solvente orgânico para aplicação cuja a fórmula molecular é C8 H8 HgO2 (National Center
for Biotechnology Information, 2026). O FM era usado como agente conservante em vacinas,
soluções nasais e oftálmicas juntamente com timerosal, outro composto organomercurial, onde
foram diminuindo seus usos, ou até banidos e substituídos por outros mais eficazes e sem
mercúrio a partir do fim do século XX (NASCIMENTO; CHASIN, 2001).
Em um estudo que administrou FM em ratos, chegaram a conclusão que a maior parte
é rapidamente metabolizado nos tecidos em mercúrio inorgânico e benzeno. No organismo,
o benzeno pode ser metabolizado em fenol, e uma pequena parte desses compostos pode ser
transformada em hidroquinona (também chamada de quinol), sendo ambos excretados na urina
após conjugação (DANIEL et al., 1972). O benzeno, encontrado principalmente na gasolina e no
tabagismo, é considerado um composto de relevância toxicológica, causando efeito carcinogênico
à saúde humana (AMARAL et al., 2017; International Agency for Research on Cancer, 1982).
Isso mostra que a presença de FM no ser humano pode levar a potenciais danos à saúde de
pessoas expostas a esse organomercurial. Uma outra pesquisa envolvendo ratos expostos ao FM,
evidenciou que houve diminuição de Erys e hemoglobina (Hb), provocando lesões, tumores e
até mortalidade nesses animais que consumiram água contaminada com FM (SOLECKI et al.,
1991).
Já o trabalho de (MILLER et al., 1960) investigou a absorção, distribuição e excreção
do FM em diferentes espécies animais, incluindo aves, roedores e cães, utilizando diferentes
vias de administração. Os autores demonstraram que o FM é absorvido predominantemente
na forma intacta e transportado pelo sangue sem alterações significativas iniciais, sendo logo
em seguida metabolizado principalmente no fígado e, de forma mais acentuada, nos rins, onde
ocorre acúmulo de mercúrio inorgânico.
A elevada toxicidade de compostos organomercuriais, como o acetato de fenilmercúrio,
está diretamente relacionada à alta afinidade do mercúrio por grupos tiol (-SH), presentes em
biomoléculas essenciais, como a Hb (PISCOPO et al., 2020). Os Erys possuem grupos sulfidrila
acessíveis tanto nas proteínas da membrana quanto na hemoglobina. A ligação do mercúrio a
esses sítios pode induzir alterações conformacionais na Hb, afetando sua estrutura e função,
além de comprometer a integridade da membrana celular por meio da modificação de proteínas
37
estruturais. Como consequência, essas interações podem levar a distúrbios no transporte de
oxigênio, a espécies reativas de oxigênio que prejudica o poder antioxidante dos eritrócitos e à
perca da homeostase celular, tornando as células vermelhas um modelo sensível para investigar
os efeitos tóxicos de compostos mercuriais (AHMAD; MAHMOOD, 2019).
No Brasil, o uso do FM ocorria muito para o combate de fungos, como exemplo temos
no uso em tintas durante a etapa de armazenamento no intuito de protegê-las de microrganismos
que foram substituídas por composições menos nocivas ao ambiente aos poucos, a partir da
década de 1980 (MOURA, 2023). Além disso, era usado na manufatura preservativa de madeira
para controlar a formação de limo ao tratar a polpa da madeira com FM (KRUG, 1975). Por
ele ser eficaz contra fungos, era empregado em vários produtos industrias como: escova de
dentes, adesivos, filtros de condicionador de ar, borracha, couro dentre ouros (D’ITRI, 1972
apud CASTRO, 1991). Além disso, era permitido o uso de FM em maquiagem e removedores
para área dos olhos através da Resolução da Diretoria Colegiada – RDC nº 29/2012 (ANVISA,
2012) que foi revogado posteriormente pela RDC nº 528/2021 (ANVISA, 2021).
A Convenção de Minamata sobre Mercúrio, firmada em Kumamoto (2013) foi o tratado
global mais importante para frear o uso de mercúrio em diversos produtos e processos industriais.
Uma vez que ele reconhece que o mercúrio é um elemento químico muito tóxico, capaz de
acumular-se nos ecossistemas e provocar graves danos neurológicos e outros efeitos à saúde
humana e à fauna quando liberado no ambiente. O Brasil firmou compromisso através do Decreto
nº 9.470/2018 para proteger a saúde humana e o meio ambiente de emissões e liberações de
mercúrio e seus compostos provocadas por ações humanas. As medidas de eliminação progressiva
incluem, por exemplo, a produção, exportação e importação de produtos com mercúrio adicionado
tais como: baterias, lâmpadas fluorescentes, pesticidas, biocidas e antissépticos tópicos dentre
outros (Brasil, 2018).
Embora o FM seja atualmente alvo de severas restrições regulatórias no Brasil e em
diversos países, ainda sim é possível encontrá-lo no ambiente. A intoxicação por mercúrio
orgânico, pode acontecer via trato gastrointestinal, sendo a população exposta, principalmente
as que moram em regiões mais vulneráveis, são mais expostas devido ao consumo de peixes
e frutos do mar infectados por substâncias tóxicas como o FM, que são transportados, após a
absorção, pela corrente sanguínea e distribuídos para diferentes tecidos do organismo (QIU;
WANG, 2016; LEE et al., 1997). Naturalmente, o ser humano pode ser exposto por FM em outras
vias, como o contato direto com produtos antigos de beleza que utilizavam-o em suas fórmulas
químicas e tantos outros. Diante desse cenário, faz-se necessário a realização de estudos que
38
investiguem a interação do fenilmercúrio com eritrócitos humanos, visando uma compreensão
mais aprofundada dos mecanismos de toxicidade e dos danos celulares induzidos. Nesse contexto,
a análise e interpretação das alterações espectroscópicas associadas a essa interação demandam
o uso de ferramentas estatísticas, motivando a aplicação de métodos de análises multivariadas,
tema abordado na seção seguinte.
2.4
ANÁLISE MULTIVARIADA
Nesta parte, vamos abordar duas análises multivariadas: Análise dos Componentes
Principais (PCA) e Análise Discriminante Linear (LDA) que são ferramentas essências para
diferenciação de grupos. A PCA faz a separação entre grupos de forma qualitativa, já o LDA vai
além, possibilita a classificação de forma quantitativa com aprendizado de máquina.
2.4.1
Análise dos Componentes Principais - PCA
Quando analisamos um conjunto de dados que contenham muitas variáveis, no qual cada
uma das variáveis correspondem a uma característica de alguma grandeza estudada, precisamos
compreender como cada uma delas se comportam em determinada situação. Com isso, podem
surgir milhares de variáveis o que pode se tornar bastante complexo de analisar e visualizar
diferenças esperadas, portanto, para simplificar essa situação é que surge o PCA.
A Análise dos Componentes Principais (PCA) é uma forma de análise multivariada, na
qual dados complexos passam por transformações lineares. Seu objetivo principal é encontrar um
novo conjunto de variáveis (chamados de componentes principais) que seja menor que o original,
de modo que sejam não correlacionadas e que retenham a maior parte da variação presente em
todas as variáveis originais, preservando assim a maior parte dos dados (JOLLIFFE, 2002).
Vamos exemplificar essa análise com um exemplo lúdico envolvendo frutas usando
código em Python. Consideremos 2 frutas distintas: limão e banana, onde 10 de cada foram
selecionada para avaliação de pessoas. Iremos separar 4 características distintas com notas de 1
a 10 para cada uma (Tabela 1), sendo assim, temos 4 dimensões que precisamos diminuir para
poder visualizar.
39
Tabela 1 – Exemplo com Frutas e algumas características para PCA.
Frutas
Doçura
Acidez
Peso
Suculência
Limão 1
1,5
9,1
1,2
8,0
Limão 2
1,6
8,8
1,1
7,9
Limão 3
1,3
9,0
1,3
8,2
Limão 4
1,4
9,3
1,2
8,1
Limão 5
1,7
8,9
1,0
7,8
Limão 6
1,5
9,2
1,1
8,3
Limão 7
1,2
8,7
1,2
7,7
Limão 8
1,4
9,4
1,3
8,0
Limão 9
1,6
9,1
1,1
8,1
Limão 10
1,5
8,9
1,2
7,9
Banana 1
8,4
1,1
2,0
1,5
Banana 2
8,6
0,9
1,9
1,4
Banana 3
8,3
1,0
2,1
1,6
Banana 4
8,7
1,2
2,0
1,3
Banana 5
8,5
0,8
1,8
1,5
Banana 6
8,2
1,1
2,2
1,7
Banana 7
8,8
0,9
1,9
1,4
Banana 8
8,4
1,0
2,0
1,5
Banana 9
8,6
1,2
2,1
1,6
Banana 10
8,5
0,9
1,9
1,4
Fonte: Autor, 2026.
Com base nos dados da tabela, a análise PCA constrói os dados em uma matriz X(i × j),
onde i representa as linhas que no caso são 20 amostras (frutas) e j as colunas (variáveis).
Com isso, os dados são padronizados com intuito de transforma as variáveis para que possuam
média zero e variância igual a um. Cada elemento da matriz original Xij é transformado em
um elemento Zij através da fórmula Zij =
Xij −X̄j
, no qual X̄j é a média da variável j e Sj é
Sj
o desvio padrão da variável j. O resultado é a matriz padronizada Z que é usada para fazer a
matriz de covariância que nos mostra como as variáveis interagem entre si e identifica possíveis
redundâncias. Nesse caso, esse matriz terá dimensão 4×4, no qual a diagonal principal representa
as variâncias da cada variável (que será igual a 1 devido a padronização) e os valores fora da
diagonal representam a covariância entre pares de variáveis (por exemplo, a forte correlação
negativa entre doçura e acidez).
O próximo passo é encontrar as novas direções (eixos) no espaço multidimensional que
40
maximizem a variância dos dados através de transformações lineares com a matriz de covariância
C: Cv = λv. O autovalor λ representa quanta variância cada componente principal terá, se
tivermos um grande autovalor, então significa que os dados estão bem espalhados ao longo desse
eixo. Enquanto que v são os autovetores (também chamados de Loadings ou pesos) indicando a
direção dos novos eixos no espaço. Em seguida, o Componente Principal 1 (PC1) é selecionado
de tal forma que está associado ao maior autovalor (λ1 ), explicando a maior parte da variância
e o segundo maior (PC2) para formar um novo sistema bidimensional. Por fim, as amostras
originais precisam ser posicionadas neste novo sistema, a Figura 8 mostra o exemplo de gráfico
Scores da PCA.
Figura 8 – Gráfico das duas principais componentes do exemplo das frutas para PCA.
Fonte: Autor, 2026.
Pode-se notar que ele explicou um total de 99.93% dos dados utilizando, ao somar as
contribuições das componentes principais. A PC1 resumiu quase toda a informação dos dados,
mostrando que a diferença entre um limão, que é muito ácido e pouco doce, e uma banana que é
muito doce e pouco ácida, como era esperado. Esse método pode ser aplicado a várias situações
para classificação de determinados grupos.
Agora vamos abordar de forma geral com maior rigor matemático. Consideremos uma
matriz de dados X (n × p), com n observações (amostras) de p a variáveis de um vetor x, onde os
n elementos são descritos por x1 , x2 , ..., xn . Para extrair a máxima informação, buscamos uma
41
combinação linear das variáveis originais que apresente a maior dispersão possível. Queremos
maximizar a variância, uma vez que fazendo isso conseguimos maiores diferenças entre os
indivíduos. Com isso em mente, consideremos os dados centralizados com z̃i1 = aT1 xi o score da
i-ésima observação na primeira componente principal, em que i = 1, 2, ..., n, devemos escolher
o vetor de pesos aT1 tal que maximize a variância amostral, dada por:
Pn
(z̃i1 − z̄1 )2
,
var(z̃1 ) = i=1
n−1
(36)
cuja condição de normalização é aT1 a1 = 1 para evitar que a variância cresça indefinidamente
apenas pelo aumento da magnitude dos coeficientes. Vale mencionar que o expoente em aT1
significa matriz transposta. Então, aTk x é definido como a k-ésimo componente principal amostral
com k = 1, 2, ..., p, e z̃ik é o score da i-ésima observação no k-ésimo componente principal, pois
o objetivo é encontrar direções ortogonais que maximizem a variância residual em cada etapa.
A variância amostral dos scores do k-ésimo componente é λk (o k-ésimo maior autovalor
da matriz de covariância amostral), ou seja:
var(z̃k ) = λk ,
(37)
com seu autovetor correspondente ak para k = 1, 2, ..., p, os autovalores são organizados de
forma decrescente (λ1 ≥ λ2 ≥ · · · ≥ λp ), garantindo que a primeira componente tenha a maior
parcela da variabilidade.
Definimos agora a matriz ortogonal de transformação A (p × p), cujas colunas são os
autovetores a1 , a2 , . . . , ap . A transformação do conjunto de dados original para o novo sistema
de coordenadas é realizada através da operação matricial:
Z̃ = X̃A,
(38)
onde X̃(n × p) representa os dados originais centrados na média e Z̃ a matriz de scores. Temos
que X̃ pode ser escrito como:
(x11 − x̄1 ) (x12 − x̄2 )
(x21 − x̄1 ) (x22 − x̄2 )
X̃ =
..
..
.
.
(xn1 − x̄1 ) (xn2 − x̄2 )
. . . (x1p − x̄p )
. . . (x2p − x̄p )
.
..
...
.
. . . (xnp − x̄p )
(39)
A variância da projeção dos dados pode ser escrita em termos da matriz de covariância amostral
dos dados centralizados. Definindo a matriz de covariância como:
S=
1
X̃T X̃,
n−1
(40)
42
no qual, a matriz de covariância S tem elementos:
Pn
(x̃ij − x̄j )(x̃ik − x̄k ))
,
cov(xj , xk ) = i=1
n−1
(41)
onde a média aritmética de xj é definida como:
n
1X
x̄j =
xij .
n i=1
(42)
Enquanto que a matriz de Pesos ou Loadings (A) pode ser expressa como:
a11 a12 . . . a1p
| |
|
a21 a22 . . . a2p
A = a1 a2 . . . ap =
.. . .
. .
..
. ..
.
.
| |
|
ap1 ap2 . . . app
A partir de (38), temos que
z̃11 z̃12 · · · z̃1p
PCA11 PCA21
z̃21 z̃22 · · · z̃2p PCA12 PCA22
Z̃ =
.. . .
..
..
..
= ..
.
.
.
.
.
.
PCA1n PCA2n
z̃n1 z̃n2 · · · z̃np
· · · PCAp1
· · · PCAp2
..
..
,
.
.
· · · PCApn
(43)
(44)
onde cada elemento z̃ik = aTk xi representa o score da i-ésima observação na k-ésima componente principal. Assim, as colunas da matriz Z̃ correspondem às componentes principais
PCA1, PCA2, . . . , PCAp, enquanto as linhas representam as observações originais no novo espaço de menor dimensionalidade. Essa transformação permite uma representação compacta dos
dados, preservando a maior parte da variância total do conjunto original facilitando a identificação
de padrões e tendências estruturais. Entretanto, embora o PCA seja uma técnica não supervisionada voltada à maximização da variância, a nossa dissertação também demanda métodos capazes
de considerar previamente a separação entre classes experimentais. Nesse contexto, destaca-se a
Análise Discriminante Linear (LDA), um método supervisionado fundamentado na maximização
da separação entre grupos, que será detalhadamente abordado no capítulo subsequente.
2.4.2
Análise Discriminante Linear - LDA
A Análise Discriminante Linear (LDA) é uma ferramenta estatística multivariada que usa
aprendizado de máquina supervisionada para classificação e redução de dimensionalidade de
dados. Foi introduzida por Fisher em 1930, onde seu objetivo principal era descrever combinações
lineares das variáveis originais que maximizem a separação entre grupos previamente definidos
(JOHNSON; WICHERN, 2007). A principal diferença entre PCA e LDA é que este possui um
43
método supervisionado com ênfase em maximizar as separabilidades entre classes e minimizar a
dispersão dentro da cada classe, enquanto que aquele é não supervisionado focado em maximizar
a variância dos dados de forma qualitativa. A LDA geralmente é usada quando é necessário
melhorar a classificação realizada na PCA, possibilitando uma análise mais realista da situaçãoproblema envolvida nos dados.
Consideremos um conjunto de dados composto por K classes, onde cada observação
é representada por um vetor x ∈ Rp . Seja µk o vetor média da classe k, µ a média global, p
representando a dimensão e nk o número de observações da classe k. Define-se a matriz de
dispersão dentro de classes SW , a qual mede a variabilidade dos dados dentro de cada classe,
como:
SW =
K X
X
(xi − µk )(xi − µk )T ,
(45)
k=1 xi ∈Ck
já a matriz de dispersão entre classes:
SB =
K
X
nk (µk − µ)(µk − µ)T ,
(46)
k=1
representando a separação entre os centros das classes.
O critério do discriminante de Fisher consiste em determinar o vetor de projeção w que
maximiza a razão entre a variância projetada entre classes e a variância projetada dentro das
classes, então:
J(w) =
wT SB w
.
wT SW w
(47)
A maximização desse funcional leva ao problema de autovalor generalizado
S−1
W SB w = λw,
(48)
onde λ é autovalor cujas soluções fornecem os eixos discriminantes.
Para um problema com K classes, o número máximo de componentes discriminantes é
K − 1. A projeção dos dados nesse subespaço resulta em uma representação de menor dimensão
que maximiza a separação entre classes. Por exemplo, se K = 3 então a visualização dos dados
se dará em um gráfico bidimensional que separa as classes em cores (HASTIE et al., 2009).
O LDA tem como premissa que as classes sigam distribuições normais multivariadas com
matrizes de covariância iguais, hipótese que garante funções discriminantes lineares. Com essas
considerações, as funções discriminantes obtidas são lineares e podem ser utilizadas tanto para
visualização quanto para classificação de novas observações. Essa técnica é muito empregada
em reconhecimento de padrões como em análises de reconhecimento facial, de emoções dentre
outras possibilidades (JOHNSON; WICHERN, 2007).
44
Vamos ilustrar o poder dessa ferramenta com um exemplo prático, novamente usando
Python, com código de (THEVAPALAN, 2025). Considerando as medidas de grãos de trigo de
três variedades diferentes da biblioteca da UCI (CHARYTANOWICZ et al., 2010). Na Figura 9
é possível ver algumas linhas dos dados:
Figura 9 – Alguns dados dos grãos analisados para exemplo LDA.
Fonte: Autor, 2026
De início, ao enviar o arquivo com os dados para o código, é necessário fazer um préprocessamento dos dados para verificar se eles têm algum valor faltando e ver quantos exemplos
pertencem a cada categoria. Em seguida, é realizado a redução da dimensionalidade, resultando
em duas características principais, onde chegamos a 67, 7% ao LD1 e 32, 3% para o LD2, o que
somando as duas temos 100%. Podemos observar na Figura 10 o resultado do gráfico LDA na
direita e na esquerda temos o gráfico com dados originais (com área e perímetro) para visualizar
as categorias dos grãos bem separadas.
Figura 10 – Gráfico com os dados originais à esquerda e separação pela LDA à direita.
Fonte: Autor, 2026
Além disso, é possível usar a classificação, com os dados de treinamento o LDA nos
possibilita treinar o modelo para reconhecer as diferentes categorias de trigo, sendo assim, uma
avaliação com aprendizado de máquina. Esse modelo acertou o tipo de trigo em aproximadamente
92% das vezes, como podemos observar pela Figura 11, onde é um excelente resultado.
45
Figura 11 – Classificação LDA dos grão de trigo.
Fonte: Autor, 2026
Dessa forma, ao integrar redução de dimensionalidade com capacidade discriminativa
supervisionada, a LDA constitui um ferramental teórico consistente para a análise comparativa
dos espectros obtidos nesta pesquisa, permitindo avaliar de maneira objetiva a separação entre
grupos experimentais, como é o caso das células vermelhas saudáveis e aquelas expostas ao
fenilmercúrio, e consolidando a fundamentação estatística adotada neste trabalho para uma
melhor análise.
46
3 METODOLOGIA EXPERIMENTAL
3.1
DESCRIÇÃO DA PLATAFORMA OPTO-ACUSTOFLUÍDICA
Para a realização dos espectros Raman de Erys utilizamos a configuração do sistema
opto-acustofluídico. Composto por um gerador de funções (33220A, Agilent, EUA) conectado
em paralelo a um osciloscópio (TDS 2012C, Tektronix, EUA) de 50 MHz e em série o dispositivo acustofluídico (GAFM, BR). Este é acoplado ao LabRam HR Evolution (Horiba, França)
equipado com um detector Synapse e uma câmera CCD resfriada, como podemos observar pela
Figura 12.
Figura 12 – Configuração experimental do sistema opto-acustofluídico constituído de uma gerador de funções, um osciloscópio, um dispositivo acustofluídico acoplado ao LabRam
HR Evolution
Fonte: Autor, 2026
Esse sistema possibilita o monitoramento bioquímico de partículas e células em dimensões de microlitros de forma imediata sem que haja mudanças na posição do foco aumentando
assim o sinal Raman.
O dispositivo acustofluídico foi confeccionado e idealizado pelo GAFM. Ele é composto
por dois microcanais, um de entrada (inlet) e outro de saída (outlet), ambos com raio de
1,0 mm que conduzem a uma microcavidade cilíndrica. Esta possui em sua base uma cerâmica
piezoelétrica do tipo Zirconato de Chumbo e Titânio (PZT). A microcavidade é selada com
uma lamínula de vidro com espessura d = 150 µm. Na Figura 13 vemos um corte seccional da
geometria no software FreeCAD do achip.
47
Figura 13 – Representação de um corte seccional da geometria de distribuição dos materiais
utilizados na confecção do dispositivo de acustofluídica.
Fonte: Autor, 2026
Esse dispositivo acustofluídico tem, em sua microcavidade cilíndrica, 2R = 3,6 mm de
diâmetro com altura H = 250 µm, no qual seu principal plano de aprisionamento é em torno de
h = 100 µm. A equação que satisfaz a região de trabalho do sistema opto-acustofluídico para
aquisição de espectros Raman de células é:
w ≥ d + H − h = 300 µm,
(49)
sendo w = 600 µm a nossa distância de trabalho.
3.2
COLETA DE ERYS E SEPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
Nesta seção, ficaram responsáveis os membros do Laboratório de Bioenergética (LaBio),
do Instituto de Química e Biotecnologia (IQB) da UFAL como colabores da pesquisa. A coleta
de sangue dos voluntários aconteceu por meio de punção venosa com tubos de coleta a vácuo da
marca Olen contendo EDTA-K3 (ácido etilenodiamino tetra-acético) cuja concentração foi de
198 µg/mL como anticoagulante. Esse trabalho foi autorizado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
da UFAL (CAAE 02840318.2.0000.5013).
Todas as amostras de sangue coletadas foram centrifugadas à 2345 g durante 10 min à
uma temperatura ambiente de aproximadamente 28 ◦ C com intuito de separar os Erys do plasma,
conforme a Figura 14. Em seguida, os Erys foram submetidos à quantificação do teor total de
proteínas pelo método de referência de Bradford.
48
Figura 14 – Separação do sangue para o grupo controle, onde foram tirados de 6 voluntários
saudáveis.
Fonte: Autor, 2026.
Estando o todo aparato configurado e achip limpo, preenchemos-o com tampão PBS
(Solução Salina Tamponada com Fosfato) afim de preservar a integridade das células vermelhas.
Logo em seguida, pipetamos 5 µL de Erys no inlet e esperamos o fluxo laminar estabilizar
dando início ao aprisionamento na região central da microcavidade, cerca de 10 minutos depois,
o agregado se estabiliza levitando no plano nodal devido a força de radiação acústica, como
podemos observar pela Figura 15.
Figura 15 – Aprisionamento de Erys (controle) na objetiva de 10X (a) e 40X (b)
Fonte: Autor, 2026
Depois de aprisionado, o laser Raman foi focalizado no centro de um dos Erys na objetiva
de 40x (Olympus Corp., Japão) e abertura numérica N A = 0,65, com 1% da potência do laser
de 532 nm, equivalente a 2,50 mW totalizando 250 mW, Hole de 450 µm, grade de difração
de 300 ranhuras/mm, resolução espectral na ordem de 4 cm−1 , tempo de aquisição de 12 s e
acumulação com 10 tendo aproximadamente 2 min para cada espectro tomado; com o intervalo
49
espectral de 300–1800 cm−1 . Os espectros foram tomados para cada célula do aglomerado, numa
temperatura de 22 ◦ C e isolados de radiações eletromagnéticas externas de modo a minimizar
interferências nos espectros.
Como uma das formas de analisar as influências do FM nos Erys, foi executado em parceria pelo LaBio a capitação de oxigênio nos Erys através de um oxígrafo (Hansateh Instrument),
em uma câmera de vidro com 1,0 mL equipada com um agitador magnético na temperatura de
28 ◦ C em dois grupos: controle e outro com fenilmercúrio. Conforme descrito por (ROBINSON;
COOPER, 1970), a concentração inicial de oxigênio foi de 225 nmolO2 /mL. Após a calibração
do eletrodo com N a2 S2 O4 (zero), os Erys foram incubados por 3 min com a concentrações de
FM de 1,0 µM para a realização do experimento. Além da análise feita pelo grupo do LaBio,
separamos outros dois métodos para analisar a influência do FM. O primeiro foi separar 10 µL de
Erys e 8 µL de FM em um microtubo tipo Eppendorf onde foi encubado por 3 min e em seguida,
pipetamos 5 µL da amostra, considerando que o microcanal do dispositivo já foi preenchido com
tampão PBS. Vamos considerar esse método como FM1.
No método 2, no qual chamaremos de FM2, fizemos a interação no microcanal, ao pipetar
10 µL de células vermelhas saudáveis no inlet, esperamos o fluxo diminuir e só então pipetamos
8 µL de FM. O tempo para interação seria inicialmente de 3 min, todavia, o tempo de formar
o aglomerado foi cerca de 10 min para então realizar as aquisições de espectros Raman em
diferentes Erys do conjunto formado. Podemos observar pela Figura 16 o esquema resumido dos
dois métodos realizados por nós.
Figura 16 – Esquema de preparação dos dois métodos utilizados: no FM1 é feito a incubação
dos Erys com FM de forma externa e no FM2 ocorre no interior do achip.
Fonte: Autor, 2026
50
3.3
CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS E AQUISIÇÃO DE ESPECTROS RAMAN
Para o início dos experimentos, o gerador de função foi configurado com uma voltagem de
10 V pico a pico e frequência de 3,52 MHz conectado ao osciloscópio em paralelo, confirmando a
frequência e a voltagem apresentando uma leve queda, e em série com o dispositivo acustofluídico.
O LabRam é calibrado utilizando uma amostra padrão de silício, na faixa espectral de 520 cm−1 .
O dispositivo acustofluídico é sempre limpo todas as vezes antes de tomar espectros, com 10 mL
de álcool etílico 99% utilizando uma seringa e um escalpe conectado no inlet do dispositivo.
Ao todo, preparamos 6 grupos controle e 6 com fenilmercúrio. A concentração de Erys
para todos os espectros realizados foi de 2,85 µg/mL de células em solução PBS, enquanto que
o FM foi de 1 µmol. No próximo capítulo veremos os resultados obtidos e posterior discussões
relevantes da nossa dissertação.
51
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Com o objetivo de quantificar possíveis alterações estruturais nos eritrócitos expostos ao
acetato de fenilmercúrio (FM), foram calculados parâmetros espectrais a partir das intensidades
relativas de bandas Raman características da hemoglobina e da membrana lipídica. A utilização de
razões espectrais permite reduzir efeitos experimentais associados à intensidade absoluta do sinal,
possibilitando uma análise comparativa mais robusta entre os diferentes grupos experimentais.
Os parâmetros espectrais considerados neste estudo estão relacionados a três aspectos principais
da célula: (i) organização estrutural da membrana eritrocitária, (ii) estado de oxigenação da
hemoglobina e (iii) alterações estruturais no ambiente do grupo heme. A análise conjunta desses
parâmetros permite investigar possíveis mecanismos de interação do FM com os Erys.
4.1
AQUISIÇÃO E ANÁLISES DOS ESPECTROS RAMAN DOS ERITRÓCITOS
Através do sistema opto-acustofluídico apresentado na seção anterior (Figura 12), obtive-
mos os espectros das células vermelhas para três grupos: controle, FM1 e FM2. Os espectros
foram adquiridos com a objetiva de 40x e abertura numérica N A = 0,65; Hole de 450 µm ;
grade de difração de 300 ranhuras/mm; tempo de aquisição de 12 s e acumulação com 10; com
o intervalo espectral de 300–1800 cm−1 e laser Raman de 532 nm e 2,50 mW de potência. Eles
passaram por uma seleção com intuito de remover alguns espectros ruins. Em seguida, fizemos
a correção de baseline com um polinômio de grau 7 e 10 pontos de mínimos, ou seja, onde a
primeira derivada é nula e a concavidade da curva é voltada para cima. Este método permite a
remoção da fluorescência de fundo sem distorção das bandas vibracionais, preservando a integridade físico-química das assinaturas Raman celulares. Posteriormente, aplicamos a suavização
de Savitzky-Golay, com 5 pontos num polinômio de grau 2 e normalizamos os dados pela área
através do software LabSpec 6, no intuito de poder comparar os espectros controle com FM.
A Figura 17 apresenta o perfil espectral médio do grupo controle (eritrócitos saudáveis),
obtido a partir da média aritmética de 46 espectros. A excitação Raman em 532 nm situa-se
na região das bandas Q da hemoglobina, promovendo um regime de pré-ressonância, o que
resulta na intensificação dos modos vibracionais associados ao grupo heme (Torres Filho et al.,
2008). Como consequência, observam-se bandas características associadas ao anel de porfirina
da Hb, as quais podem ser divididas em quatro regiões importantes: a região de baixo número de
onda (600–1200 cm−1 ); a região de deformação C−H da metina (1300–1200 cm−1 ); a região
de estiramento do anel de pirrol (1300–1400 cm−1 ); a região da banda marcadora do tamanho do
52
núcleo ou estado de spin (1500–1650 cm−1 ) (RUSCIANO et al., 2008). O espectro Raman inclui
assinaturas moleculares, bioquímicas e estruturais importantes como as informações de lipídeos,
proteínas e metabólicos intracelulares.
Figura 17 – Espectro Raman médio de 46 Erys do grupo controle.
Fonte: Autor, 2026.
Em posse do espectro médio das Erys controle, agora iremos comparar com os grupos
expostos ao metal pesado FM nos dois métodos executados. Para o método 1, denominado FM1,
no qual foi realizado a incubação exterior ao achip durante 3 minutos conforme visto na seção da
metodologia, utilizamos os mesmos parâmetros de aquisição que fizemos no controle. A Figura
18 apresenta o primeiro passo da comparação entre o grupo controle (eritrócitos saudáveis) e
o grupo de eritrócitos expostos ao método FM1. Nela podemos observar os espectros médios
de cada grupo, bem como o espectro resultante da subtração entre eles, com o objetivo de
evidenciar possíveis diferenças espectrais. Essa abordagem permite identificar quais bandas
Raman apresentam aumento ou diminuição de intensidade devido à exposição ao FM1. Os
espectros médios foram obtidos a partir da média aritmética de 46 espectros do grupo controle e
28 espectros de eritrócitos expostos ao FM1, garantindo a contribuição de todos os voluntários
analisados. Cada espectro tomado foi adquirido em uma única célula, utilizando o laser Raman
de 532 nm com potência de 2,50 mW focalizado no centro dos Erys.
53
Figura 18 – Espectros Raman médios dos grupos controle (em preto) e FM1 (vermelho) (a), na
inserção temos o laser Raman focalizado em uma Ery e a diferença dos espectros
médios em (b).
Fonte: Autor, 2026.
Pode-se notar que os sinais Raman do controle e do FM1 são similares, no entanto,
há diferenças entre as intensidades dos picos e nas posições das bandas para alguns modos
vibracionais. No gráfico das diferenças entre os grupo em (b) é possível observar a variação da
intensidade relativa, onde a curva cruza o zero temos que não há diferença nenhuma entre os
dois grupos naquela frequência específica. Por outro lado, picos positivos representam que a
intensidade do grupo controle é maior do que o FM1 naquele ponto, por exemplo próximo de
1600 cm−1 . Já os picos negativos, significa que a intensidade do grupo FM1 é maior que a do
grupo controle
Para efeitos de comparação dos dois grupos, consideramos a partir da banda de ∼
990 cm−1 para poder avaliar o quanto diferem as intensidades dos principais picos Raman, cuja
tais mudanças podem indicar modificações nas células vermelhas. Com isso, na Tabela 2 temos
a distribuição de algumas bandas dos espectros que se destacam para estimar a interferência do
fenilmercúrio nos Erys pelo método FM1, no qual as coordenadas e e componentes celulares são
baseadas nos trabalho de (HU et al., 1996; RUSCIANO et al., 2008).
54
Tabela 2 – Posições de bandas Raman, mudanças de intensidades em relação ao controle indicando aumento (seta para cima) ou diminuição (seta para baixo) da intensidade,
coordenada local e componentes celulares dos Erys controle e FM1 sob excitação de
532 nm.
Banda Eryscontrole
997 cm−1
1129 cm−1
1170 cm−1
1225 cm−1
1303 cm−1
1340 cm−1
Banda Erys- Mudança Coordenada local
FM1
993 cm−1
↓
ν(Cβ C1 )asym
−1
1121 cm
↓
δ(= Cb H2 )4
−1
1166 cm
↓
ν(pyr half-ring)asym
−1
1222 cm
↓
δ(Cm H)
−1
1301 cm
↓
δ(Cm H)
−1
1338 cm
↓
ν(pyr half-ring)sym
1371 cm−1
1430 cm−1
1368 cm−1
1426 cm−1
↓
↓
ν(pyr half-ring)sym
ν(Cα Cm )sym
1585 cm−1
1582 cm−1
↓
ν(Cα Cm )asym
1636 cm−1
1632 cm−1
↓
ν(Cα Cm )asym
Componentes
Aminoácido: fenilalanina
Proteínas e lipídeos
Proteína: hemoglobina
Proteínas e lipídeos
Proteínas e lipídeos
Aminoácido: triptofano; proteínas
Heme
Lipídios: CH2 /CH3 e proteínas
Proteínas, lipídeos: amida II,
triptofano
Proteína: Amida I
Fonte: Autor, 2026.
Vemos que todas as bandas com FM1 analisadas na Tabela 2 estão com deslocamentos
Raman inferiores ao controle, isso evidencia que a presença do fenilmercúrio está interagindo
estruturalmente com a hemoglobina, nos lipídios e nas proteínas da membrana das Erys, o que
faz com que elas vibrem com um pouco menos de energia. Os picos entre 1500 e 1700 cm−1 são
influenciados pelo estado de spin do ferro, ou ainda, através do estado de oxigenação do eritrócito.
Tais modificações estruturais são corroboradas pelo espectro de diferença em 18 no qual exibe
um comportamento de baixas e altas intensidades nessas respectivas regiões, confirmando que
a ação do FM altera não apenas a intensidade, mas a assinatura físico-química do grupo heme.
As bandas próximas de 740 à 1130 cm−1 são caracterizadas como a região que apresenta maior
concentração de lipídios e em 1130 à 1690 cm−1 temos a região com predominância de proteínas
(LENZI et al., 2021).
Para o outro método, em que a incubação acontece no interior do achip conforme dito na
metodologia, na Figura 19 apresentamos os espectros médios e a diferença entre os grupos, no
qual também fizemos uma média aritmética de 46 espectros controles e 25 FM2. Ademais, os
parâmetros foram os mesmos que o anterior para aquisição Raman.
55
Figura 19 – Espectros Raman médios dos grupos controle (em preto) e FM2 (vermelho) (a), na
inserção está o laser Raman focalizado, e em uma Ery e a diferença dos espectros
médios em (b).
Fonte: Autor, 2026.
A análise espectral do tratamento com FM2 revelou um perfil de alteração distinto
em relação ao observado no FM1. Percebe-se que existe uma grande similaridade entre os
dois grupos, inclusive maior que o método FM1, porém há uma elevação das intensidade de
alguns picos. No espectro da diferença (b), temos vales negativos pronunciados nas regiões
correspondentes aos modos vibracionais do anel de porfirina, notadamente em torno de 1585 e
1636 cm−1 . Isso indica um aumento significativo na intensidade Raman dessas bandas no grupo
tratado com FM2, sugerindo que esse método induz modificações conformacionais na Hb que
alteram o ambiente eletrônico do grupo heme, mas com mínimas diferenças dos deslocamentos
de frequência característicos observados no tratamento com FM1. Podemos observar na Tabela 3
as principais bandas para esse método.
56
Tabela 3 – Posições de bandas Raman, mudanças de intensidades em relação ao controle indicando aumento (seta para cima) ou diminuição (seta para baixo) da intensidade,
coordenada local e componentes celulares dos Erys controle e FM2 sob excitação de
532 nm.
Banda Eryscontrole
997 cm−1
1129 cm−1
1170 cm−1
1225 cm−1
1303 cm−1
1340 cm−1
Banda Erys- Mudança Coordenada local
FM2
996 cm−1
↓
ν(Cβ C1 )asym
−1
1126 cm
↓
δ(= Cb H2 )4
−1
1170 cm
ν(pyr half-ring)asym
−1
1223 cm
↓
δ(Cm H)
−1
1303 cm
δ(Cm H)
−1
1339 cm
↓
ν(pyr half-ring)sym
1371 cm−1
1430 cm−1
1371 cm−1
1428 cm−1
1585 cm−1
1585 cm−1
ν(Cα Cm )asym
1636 cm−1
1636 cm−1
ν(Cα Cm )asym
↓
ν(pyr half-ring)sym
ν(Cα Cm )sym
Componentes
Aminoácido: fenilalanina
Proteínas e lipídeos
Proteína: hemoglobina
Proteínas e lipídeos
Proteínas e lipídeos
Aminoácido: triptofano; proteínas
Heme
Lipídios: CH2 /CH3 e proteínas
Proteínas, lipídeos: amida II,
triptofano
Proteína: Amida I
Fonte: Autor, 2026.
Ao analisar tanto os gráficos (Figura 19) quanto a Tabela 3, percebemos que esse método
não pareceu ser mais destrutivo quanto o FM1. Era de se esperar que a incubação do FM no
interior da microcavidade causasse maior dano aos Erys, mas os resultados aparentemente
mostram poucas variações espectral entre o controle e FM2.
Tanto para os métodos FM1 e FM2 por meio da subtração dos grupos não é possível fazer
uma classificação adequada dos grupos alvos. Nesse sentido, faz-se necessário incluir análises
estatísticas mais refinadas. Na próxima seção, vamos abordar as análises multivariadas PCA e
LDA para classificação estatísticas dos grupos em ambos os métodos.
4.2
ANÁLISE MULTIVARIADA DOS DADOS
Nesta parte, utilizaremos as técnicas de análise multivariadas PCA e LDA no conjunto
dos espectros Raman adquiridos. A análise PCA foi realizada num ambiente Google Colab na
linguagem Python, enquanto a LDA foi realizada em parceria com a Jennifer1 .
1
Doutoranda da Pós-Graduação em Física da UFAL e membro do Grupo de Óptica e Nanoscopia (GON) também
da UFAL.
57
4.2.1
PCA para classificação dos grupos de Erys
A estruturação e a manipulação matricial dos dados foram realizadas usando as bibliotecas
NumPy e Pandas; e para redução de dimensionalidade, a PCA como um todo, utilizamos
biblioteca Scikit-learn, mais especificamente o módulo sklearn.decomposition na linguagem
Python. As análises foram produzidas por espectros Raman na faixa espectral de 900 a 1700 cm−1
para avaliar as principais diferenças.
No método FM1, o código foi rodado contendo 261 linhas e 74 colunas, no qual cada
coluna representa um espectro Raman de uma célula vermelha. Como podemos notar pela Figura
20, o algoritmo tem como resposta as duas principais componentes (PC1 e PC2), onde é possível
ver em (a) a análise PCA referente aos grupos controle e FM1 que apresenta na componente PC1
43,61% e na 20,51% PC2, totalizando 64,12% de indivíduos nos novos eixos, além disso, uma
elipse de confiança de 95% delimita os dois grupos. Em (b) temos o gráfico Loadings para PC1
onde os valores positivos representam em sua grande parte o tratamento com FM e em (c) para
PC2 no qual a parte positiva mostra a influência de FM enquanto que os negativos o controle.
Figura 20 – Análise PCA dos grupos controle e FM1 (a), Loadings do gráficos PC1 (b) e para
PC2 do conjunto (c).
Fonte: Autor, 2026.
Percebe-se que o grupo controle ficou quase que completamente abaixo do eixo PC2 e
mais à esquerda de PC1, enquanto que o grupo FM1 está predominantemente na parte superior
do eixo PC2 e mais à direita de PC1. No gráfico dos Loadings vemos que há picos positivos
e negativos tanto (b) quanto em (c), como por exemplo as regiões com contribuição positiva
em PC2 — relacionadas ao grupo FM1 — estão concentradas principalmente nas bandas em
∼ 1589 cm−1 , ∼ 1604 cm−1 , ∼ 1636 cm−1 , ∼ 1371 cm−1 e ∼ 1340 cm−1 , todas associadas
58
a modos vibracionais característicos do grupo heme da hemoglobina, incluindo marcadores
sensíveis ao estado eletrônico e de oxigenação, isso significa que o tratamento introduziu
uma vibração muito forte nessas regiões. Por outro lado, as contribuições negativas de PC2,
associadas ao grupo controle, concentram-se em regiões como ∼ 1430 cm−1 , ∼ 1303 cm−1 , ∼
1225 cm−1 , ∼ 1170 cm−1 e ∼ 1129 cm−1 , tipicamente relacionadas a componentes estruturais
mais gerais, como lipídios e proteínas. Esses resultados indicam que a separação observada no
PCA é majoritariamente governada por modificações no ambiente do grupo heme, sugerindo
que o tratamento FM1 promove alterações eletrônicas e estruturais na hemoglobina das células
vermelhas.
Já na Figura 21, temos o método do FM2 que em sua componente principal PC1 tem
41,07% de contribuição e 21,05% no eixo PC2, com um total de 62,12% das representações
juntamente com a elipse de confiança de 95% e os gráficos Loadings:
Figura 21 – Análise PCA dos grupos controle e FM2 (a), Loadings do gráficos PC1 (b) e para
PC2 do conjunto (c).
Fonte: Autor, 2026.
É evidente que a separação entre os dois grupos não foi satisfatória, como o método
anterior. A maior parte do grupo FM2 ficou no lado negativo da componente PC1, no qual os
picos negativos do gráfico Loadings em (b) tem forte contribuição na separação dos grupos,
embora uma parte dos espectros controle tenham ficado neste mesmo lado. Observamos que a
separabilidades não foi boa o que está em linha com os resultados quantitativos analisados nas
seções anteriores, que mostraram poucos danos celulares nos Erys com o método FM2.
Para os três grupos, a Figura 22 exibe o gráfico dos pontos nas três primeiras componentes
que totaliza 76% da representação dos grupos com elipsoides de 95% de confiança que delimita
59
os três grupos, além disso, temos gráficos em (b) que mostram quanta variância cada componente
principal carrega e no gráfico inserido mostra a quantidade de componentes que são necessárias
para representar o sistema.
Figura 22 – Análise PCA dos grupos controle, FM1 e FM2 (a), gráfico que explica quanta
variância é representada por cada fator e inserido nele temos o gráfico da 2º derivada,
mostrando o ponto de inflexão, onde determina o limite de componentes necessárias
para representar o sistema (b).
Fonte: Autor, 2026.
Observamos que o método FM1 apresentou uma melhor separabilidade entre os demais
grupos, ao contrário do método FM2 que está mais espalhado com o controle sendo difícil separar
os dois grupos. Por isso, para termos uma melhor classificação dos grupos, na seção seguinte
iremos utilizar uma análise mais robusta, que usa algoritmo de machine learning supervisionado,
o LDA.
4.2.2
LDA para classificação dos grupos de Erys
No que se refere à análise LDA, realizada através de código em Python, adotou-se a
estratégia de redução de alta dimensionalidade dos dados espectrais por meio da PCA, para
então aplicar o LDA. As 10 primeiras Componentes Principais (PCs) da matriz de scores da
PCA, que concentram a maior contribuição da variância explicada acumulada (91, 3%), foram
utilizadas como variáveis de entrada para o treinamento da Análise Discriminante Linear (LDA),
empregando a biblioteca Scikit-learn. Essa etapa permitiu otimizar o espaço discriminante,
maximizando a variância interclasses e minimizando a variância intraclasse.
Podemos observar pela Figura 23 que a separação dos três grupos ocorreu, com mais
ênfase entre FM1 e controle, em contrapartida, observou-se uma sobreposição parcial entre o
60
controle e o FM2, sugerindo que este último induz modificações mais sutis e menos discriminantes no espaço multivariado. A análise por LDA evidenciou que o eixo LD1 foi responsável pela
maior contribuição com 92, 9% da variância discriminante. Nos gráficos dos Loadings associada
aos LD1 e LD2 em (b) e (c), temos que os picos positivos e negativos indicam quais bandas
Raman contribuíram para a separação entre os grupos, onde temos bandas que se destacam com
picos positivos no LD1 — relacionadas principalmente ao grupo FM1 — como por exemplo
em ∼ 1559 cm−1 , ∼ 1604 cm−1 , ∼ 1636 cm−1 , ∼ 1371 cm−1 , ∼ 1320 cm−1 e ∼ 1120 cm−1
que estão relacionados a alterações conformacionais no grupo heme, incluindo deformações
do anel porfirínico, desorganização estrutural da membrana lipídica e também nas proteínas.
Essas mudanças podem estar relacionadas a processos de estresse oxidativo e reorganização
estrutural da membrana eritrocitária. Por outro lado, no LD2, podemos observar que os picos
positivos em (c) indicam uma boa parte do grupo FM2, tendo menores quantidades de picos que
o outro gráfico Loadings (LD1) o que está de acordo com os resultados anteriores, uma vez que
esse grupo se mostrou similar, em relação ao controle, tendo como principal pico distinto em
∼ 1585 cm−1 .
Figura 23 – Gráficos dos pontos LDA para os três grupos (a), Loadings do LD1 (b) e LD2 (c)
Fonte: Autor, 2026.
Esse resultado demonstra que a exposição causado pelo FM alterou as células vermelhas
e possibilitou a diferenciação entre células sadias e aquelas afetadas pelo metal pesado, com
melhor separabilidade observada para o método FM1. Ademais, está de acordo com análises
PCA realizada anteriormente, onde percebemos que a LDA foi capaz de capturar diferenças mais
sutis em um maior número de regiões espectrais, justamente por se tratar de uma abordagem
supervisionada que incorpora informações de classe. Isso possibilita capturar diferenças mais
61
sutis distribuídas ao longo de múltiplas regiões espectrais, o que é particularmente relevante
em sistemas biológicos complexos, como o nosso trabalho. A capacidade preditiva e a robustez
do modelo utilizado foram avaliadas por meio da validação cruzada Leave-One-Out (LOOCV),
implementada com a biblioteca Scikit-learn. Nesse procedimento iterativo, um único espectro é
separado para teste, enquanto os demais são utilizados no treinamento do classificador PCA-LDA,
repetindo-se o processo até que todas as amostras sejam preditas de forma independente. Essa
abordagem garante que o modelo é confiável, provando a eficiência real do modelo para novos
dados.
A matriz de confusão da LDA, apresentada na Figura 24, evidencia o desempenho
do modelo na classificação dos três grupos, no qual o modelo apresentou acurácia global de
74, 7%. Percebemos que o grupo controle não foi confundido com o FM1, indicando uma boa
separação entre esses dois conjuntos. Porém, houve uma taxa de confusão de 19,6% entre
controle e FM2, sugerindo similaridade espectral parcial entre eles. O grupo FM1 apresentou o
melhor desempenho, com 89, 3% de acerto, reforçando sua distinção em relação aos demais. Em
contrapartida, o FM2 exibiu o comportamento mais confuso, com somente 48,0% de classificação
correta do seu grupo, sendo frequentemente confundido com o controle 52, 0%, o que indica que
as alterações induzidas por esse método foram menos pronunciadas.
Figura 24 – Matriz de confusão LDA para os três grupos
Fonte: Autor, 2026.
Em conjunto, esses resultados demonstram que o método FM1 promove alterações
bioquímicas mais significativas nas células vermelhas, refletidas em mudanças detectáveis no
espectro Raman o que gerou em uma maior separabilidade e acurácia de classificação. Já o
FM2 não apresentou mudanças suficientemente expressivas para garantir uma discriminação
robusta, corroborando as análises anteriores. Diante disso, na sequência vamos abordar análises
62
quantitativas de alguns parâmetros importantes, a fim de obter indicativos de possíveis danos
através das variações nas intensidades Raman.
4.3
ANÁLISE QUANTITATIVA
A partir de agora, vamos abordar alguns análises quantitativas com intuito de evidenciar
possíveis danos celulares do FM nos eritrócitos.
4.3.1
Parâmetro de ordem lipídica da membrana
Para avaliar as alterações conformacionais e estruturais dos lipídios da membrana eritro-
citária, iremos considerar para o grupo controle a banda de 1127 cm−1 , atribuída à vibração de
estiramento da ligação C − C associada às conformações trans, e a banda em 1084 cm−1 , relacionada às vibrações gauche do esqueleto C − C. Como foi observado um pequeno deslocamento
espectral entre os grupos controle e FM1, utilizaremos as bandas 1120 cm−1 e 1084 cm−1 para o
FM1. Para quantificar o grau de ordenamento das cadeias lipídicas, utilizamos o parâmetro de
ordem longitudinal Strans dado na equação (25), definido a partir da razão entre as intensidades das bandas associadas às conformações trans e gauche. Assim, valores maiores de Strans
indicam maior proporção de ligações C − C na conformação trans em relação à conformação
gauche,refletindo maior ordenamento e rigidez da membrana eritrocitária. Com isso, para o
grupo controle:
I1127 /I1084
= 1, 22 ± 0, 03.
1, 77
(50)
I1120 /I1083
= 1, 02 ± 0, 03.
1, 77
(51)
Strans(controle) =
E já o FM1:
Strans(F M 1) =
Percebemos que houve uma diminuição, ao tomar a razão temos um decréscimo da ordem de
20% na ordem lipídica nesse método. Esse resultado nos indica que a presença do FM nos
eritrócitos promove uma redução na rigidez da membrana, implicando perda de organização
estrutural e tornando-se mais fluida e permeável. Além disso, tal comportamento indica uma
perturbação das interações lipídio–lipídio e possível início de peroxidação lipídica, causando
dano estrutural na membrana. Em relação à permeabilidade, pode haver um desequilíbrio entre a
entrada e saída de íons, comprometendo a homeostase celular e com isso, uma possível alteração
funcional das proteínas da membrana.
Para o FM2, utilizamos a banda 1126 cm−1 e 1084 cm−1 , logo:
Strans(F M 2) =
I1126 /I1084
= 1, 19 ± 0, 04.
1, 77
(52)
63
Vemos que no método FM2 a diminuição foi menor sendo praticamente igual ao controle,
isso mostra que a interação do FM no interior da microcavidade não provocou o mesmo efeito
que externamente, o que sugere que as forças acústicas e a incubação das células no achip não
facilitaram a interação entre elas e o FM.
4.3.2
Estado de oxigenação da hemoglobina
Para investigarmos possíveis alterações no estado de oxigenação da Hb na presença do
acetato de fenilmercúrio, temos que o estado de oxigenação da hemoglobina pode ser monitorado pelas bandas Raman em aproximadamente 1375 cm−1 (oxi-hemoglobina) e 1355 cm−1
(desoxi-hemoglobina) (KOZICKI et al., 2015). Assim, a razão entre essas bandas foi utilizada
como indicador relativo da fração de hemoglobina oxigenada. Então:
RO2 (controle) =
I1371
= 0, 87 ± 0, 01;
I1355
(53)
e a razão do grupo FM1, onde utilizamos a banda 1368 cm−1 , uma vez que temos um pequeno
deslocamento em relação ao controle, então:
RO2 (F M 1) =
I1368
= 0, 80 ± 0, 01;
I1355
(54)
RO2 (F M 2) =
I1371
= 0, 90 ± 0, 01.
I1355
(55)
já a razão do grupo FM2:
Vemos que o grupo FM1 apresenta uma redução na razão em relação ao controle,
sugerindo uma menor contribuição relativa da oxi-hemoglobina. Esse resultado indica possíveis
alterações no equilíbrio entre as hemoglobinas oxigenadas e desoxigenadas, o que pode estar
ligado a pertubações no microambiente do grupo heme ou na dinâmica da ligação do oxigênio.
Em contrapartida, o grupo FM2 apresenta um leve aumento, indicando uma maior contribuição
relativa da oxi-hemoglobina, o que sugere que a interação na microcavidade acústica não
contribuiu com a exposição ao FM.
De modo geral, os resultados sugerem que a exposição ao acetato de fenilmercúrio causa
modificações no estado de oxigenação da hemoglobina, sendo mais pronunciadas no método
FM1, o que pode refletir em uma perda na capacidade da célula de regular a ligação e liberação
de oxigênio.
Para comparar com os nossos resultados, foi executado pelos os colaborados do LaBio a
captação de oxigênio de Erys expostos a 1,0 µM de FM apresentam redução na capacidade de
64
captação de oxigênio, evidenciando uma grande diferença entre o controle e com FM mostrando
uma diminuição de aproximadamente 57% em comparação ao grupo controle, conforme podemos
observar pela Figura 25. Os dados são expressos como média ± erro padrão da média (EPM),
n = 4. Diferença estatisticamente significativa em comparação ao controle (p < 0,05; teste t de
Student para amostras independentes).
Figura 25 – Captação de oxigênio entre o grupo controle e com FM (A). Quantificação da
capacidade máxima de captação de oxigênio em 10 s (B).
Fonte: Autor, 2026.
A redução da captação de oxigênio evidenciada pelo LaBio corrobora com a diminuição
das intensidade em relação ao método FM1, no qual apresentou uma diminuição em cerca de
8%. Contudo, o método FM2 não indicou redução, mas um aumento o que pode indicar que este
método não interferiu significamento no processo de oxigenação.
4.3.3
Parâmetro associado à ligação F e−O2
Iremos agora avaliar a ligação entre o ferro e o oxigênio nos Erys expostos ao FM, ao
considerar que a banda próxima de 566 cm−1 está associada ao estiramento da ligação F e−O2 na
oxi-hemoglobina, sendo um biomarcador do estado de oxigenação da hemoglobina (ATKINS et
al., 2017). Para avaliar possíveis alterações nessa ligação, utilizamos a razão entre as intensidades
desse pico com a banda em 750 cm−1 , a qual é relativamente pouco sensível ao estado de
oxigenação, servindo como referência espectral.
Para o grupo controle, obteve-se:
I566
= 0, 13 ± 0, 01;
I750
(56)
I566
= 0, 24 ± 0, 02;
I750
(57)
RF e−O2 (controle) =
enquanto que o FM1:
RF e−O2 (F M 1) =
65
observa-se um aumento dessa razão em relação ao controle. Esse comportamento não deve ser
interpretado como uma melhora fisiológica do estado de oxigenação, mas sim um indício de
alterações estruturais e/ou funcionais no grupo heme induzidas pela interação com o FM. Isso
pode modificar o ambiente do ferro no heme, afetando a intensidade da banda dessa ligação.
Enquanto que o método FM2:
RF e−O2 (F M 2) =
I566
= 0, 10 ± 0, 01;
I750
(58)
percebemos que houve uma ligeira queda em relação ao controle, sugerindo uma diminuição
da ligação ferro e oxigênio. Esse resultado pode estar relacionado a uma menor fração da
hemoglobina oxigenada ou ainda alterações conformacionais que afetam o sinal Raman. De
modo geral, os resultados indicam que a interação do composto tóxico com as células vermelhas
promove modificações que são perceptíveis no Raman associadas à ligação F e−O2 . Uma
hipótese plausível é que essa interação provoque distorções estruturais capazes de alterar a
estabilidade ou a geometria da ligação F e−O2 , o que se reflete nas mudanças observadas nas
intensidades Raman.
4.3.4
Parâmetro estrutural do grupo heme
Para identificar mudanças estruturais e do estado eletrônico do grupo heme, temos que a
banda em aproximadamente 1585 cm−1 está relacionada às vibrações do anel porfirínico da Hb
que é altamente sensível ao estado eletrônico do ferro, a oxigenação e de distorções estruturais
da heme. Sendo assim, vamos considerar a razão dessa intensidade com a banda de referência
750 cm−1 que é menos sensível (KOZICKI et al., 2015). Portanto, para o grupo controle, temos:
Rheme(controle) =
I1585
= 5, 43 ± 0, 12;
I750
(59)
e a razão do grupo FM1, onde usamos 1582 cm−1 , pois está com um pequeno deslocamento
frente ao controle:
Rheme(F M 1) =
I1582
= 6, 85 ± 0, 34.
I750
(60)
Nota-se um aumento considerável em relação ao controle, o que indica maior contribuição relativa
do modo ν(C = C) e alteração no ambiente eletrônico do anel porfirínico. Isso sugere uma
redistribuição da densidade eletrônica e perda da planaridade do anel. Além disso, temos possíveis
mudanças conformacionais na globina (parte proteica da hemoglobina) possivelmente expondo o
grupamento heme ao microambiente. Em resumo, esse aumento não deve ser interpretado como
um efeito benéfico, mas sim como um indicativo de pertubação estrutural e funcional da Hb. Esse
66
comportamento pode estar associado à interação do composto organomercurial com grupos tiol
(sulfidrila), especialmente resíduos de cisteína, o que pode induzir alterações na conformação
global da proteína, e consequentemente, repercute diretamente sobre o anel porfirínico.
Já a razão do FM2:
Rheme(F M 2) =
I1585
= 5, 67 ± 0, 13;
I750
(61)
observamos também um aumento em relação ao controle, embora menos pronunciado quando
comparado ao FM1. De forma geral, os resultados indicam que ambos as metodologias promoveram alterações no ambiente estrutural do grupo heme nos Erys, sendo o FM1 o mais elevado,
o que sugere maior grau de pertubação na estrutura da hemoglobina.
4.3.5
Comparação entre os grupos
A Tabela 4 exibe um resumo das razões espectrais das intensidades analisadas:
Tabela 4 – Resumo das razões espectrais calculadas para os três grupos, onde utilizamos o EPM
como a margem de erro.
Grupos
Strans
RO2 = I1371 /I1355
RF e−O2 = I566 /I750
Rheme = I1585 /I750
Controle
1, 22 ± 0, 03
0, 87 ± 0, 01
0, 13 ± 0, 01
5, 43 ± 0, 12
FM1
1, 02 ± 0, 03
0, 80 ± 0, 01
0, 24 ± 0, 02
6, 85 ± 0, 34
FM2
1, 19 ± 0, 04
0, 90 ± 0, 01
0, 10 ± 0, 01
5, 67 ± 0, 13
Fonte: Autor, 2026.
A análise quantitativa dos parâmetros espectrais indica que a condição associada ao
método FM1 promove alterações mais elevadas nos eritrócitos. Os resultados sugerem que a
interação com o FM está conectada a uma desorganização da estrutura lipídica da membrana, evidenciada pela redução do parâmetro de ordem (Strans ), refletindo aumento da fluidez e perda de
organização das cadeias lipídicas. Ao mesmo tempo, as variações observadas no parâmetro RO2
indicam desequilíbrio entre as formas oxigenadas e desoxigenadas da Hb, sugerindo um possível
comprometimento na ligação e liberação de oxigênio. Além disso, as mudanças Rheme e RF e−O2
apontam para modificações no ambiente eletrônico e estrutural do grupo heme, possivelmente
relacionadas a perturbações na geometria local e nas interações do ferro com seus ligantes.
De forma geral, esses resultados indicam que o método FM1 está associado perturbações
em diferentes níveis estruturais caracterizando um efeito global sobre a integridade celular. Por
outro lado, a condição analisada pelo método FM2 apresenta alterações menos pronunciadas
nos parâmetros analisados, sugerindo uma interação mais limitada com o sistema biológico e,
67
consequentemente, um menor grau de perturbação estrutural quando comparado ao método FM1.
Os resultados com um todo, quantitativos e qualitativos que incluem PCA e LDA, sugerem uma
disrupção global da integridade estrutural e funcional dos eritrócitos induzida pela exposição ao
acetato de fenilmercúrio.
68
5 CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS
Este trabalho evidenciou que é possível monitorar e apresentar potencial diagnóstico
de células vermelhas expostos ao FM através da utilização da plataforma opto-acustofluídico.
Vimos que os Erys quando expostos ao FM sofreram modificações celulares, diminuindo a
principal função dessas células relacionada a oxigenação dos tecidos do corpo. Os resultados
quantitativos do método FM1, no qual a incubação é realizada externamente ao dispositivo
acustofluídico, mostraram que a presença desse composto provoca uma desorganização lipídicoproteica, comprometendo o transporte de oxigênio e causa uma distorção no grupo heme
da hemoglobina. Enquanto que o método FM2, onde a incubação acontece no interior do
achip, não apresentou danos significativos. Já as análises multivariadas corroboraram com os
resultados quantitativos espectrais, evidenciando a separação estatística dos grupos controle
com os expostos ao FM, principalmente no método FM1 que apresentou maior sensibilidade na
detecção provocadas pelo acetato de fenilmercúrio.
Como perspectiva futura, iremos analisar os dados através de redes neurais para termos
uma melhor análise da interação entre FM e os eritrócitos, em especial na hipótese de incubação
dentro do dispositivo acustofluídico para compreendermos os menores danos capturados pelas
análises realizadas dos espectros Raman.
69
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of polystyrene. The Journal of Physical Chemistry B, ACS Publications, v. 128, n. 17, p.
4243–4254, 2024.
THEVAPALAN, A. Análise discriminante linear: Além da redução de dimensões.
2025. Acesso em: 12 mar. 2026. Disponível em: <https://www.datacamp.com/pt/tutorial/
linear-discriminant-analysis>.
Torres Filho, I. P. et al. Measurement of hemoglobin oxygen saturation using raman
microspectroscopy and 532-nm excitation. Journal of applied physiology, American
Physiological Society, v. 104, n. 6, p. 1809–1817, 2008.
WIKLUND, M.; GREEN, R.; OHLIN, M. Acoustofluidics 14: Applications of acoustic
streaming in microfluidic devices. Lab on a Chip, Royal Society of Chemistry, v. 12, n. 14, p.
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74
WOEHL, V. M.; WOEHL, O. M. Histologia. 3. ed. Florianópolis, SC: LANTEC/UFSC, 2016.
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identification and environmental monitoring of algal cells. Analytical chemistry, ACS
Publications, v. 77, n. 15, p. 4955–4961, 2005.
WOOD, B. R.; MCNAUGHTON, D. Raman excitation wavelength investigation of single red
blood cells in vivo. Journal of Raman Spectroscopy, Wiley Online Library, v. 33, n. 7, p.
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WU, J. Acoustical tweezers. The Journal of the Acoustical Society of America, Acoustical
Society of America, v. 89, n. 5, p. 2140–2143, 1991.
75
APÊNDICE A – Código do PCA em Python
A primeira versão do código foi desenvolvido pelo (D’AMATO, 2024) e posteriormente
foi aperfeiçoado pelo autor adaptando para o ambiente Google Colab.
from google.colab import files
import os
import matplotlib.pyplot as plt
import numpy as np
import pandas as pd
from sklearn.decomposition import PCA
from matplotlib.patches import Ellipse
import matplotlib.transforms as transforms
def draw_confidence_ellipse(x, y, ax, n_std=2.447, facecolor=’none
’, **kwargs):
"""
Desenha uma elipse de confianca (95%)
baseada na matriz de covariancia dos dados.
"""
if x.size != y.size:
raise ValueError("x e y devem ter o mesmo tamanho")
# Matriz de covariancia
cov = np.cov(x, y)
# Autovalores e autovetores
vals, vecs = np.linalg.eigh(cov)
# Ordenar do maior para o menor
order = vals.argsort()[::-1]
vals, vecs = vals[order], vecs[:, order]
# Angulo de rotacao da elipse
theta = np.degrees(np.arctan2(*vecs[:, 0][::-1]))
# Centro da elipse
mean_x, mean_y = np.mean(x), np.mean(y)
# Largura e altura da elipse (2 * n_std * desvio padrao)
width, height = 2 * n_std * np.sqrt(vals)
# Criacao da elipse
ellipse = Ellipse(
(0, 0),
width=width,
76
height=height,
facecolor=facecolor,
**kwargs
)
# Transformacao (rotacao + translacao)
transf = transforms.Affine2D() \
.rotate_deg(theta) \
.translate(mean_x, mean_y)
ellipse.set_transform(transf + ax.transData)
return ax.add_patch(ellipse)
def select_datas(group_name):
print(f"--- Selecione os arquivos para o {group_name} ---")
uploaded = files.upload()
if not uploaded:
raise ValueError("Nenhum arquivo enviado.")
intensities = []
raman_shift = None
for filename in sorted(uploaded.keys()):
df = pd.read_table(filename, names=[’ramanshift’, ’intensity’],
index_col=False)
if raman_shift is None:
raman_shift = df[’ramanshift’]
intensities.append(df[’intensity’])
return raman_shift, pd.concat(intensities, axis=1)
def MyPCA():
# Coleta de dados
rs, data1 = select_datas("Grupo 1 (Controle)")
_, data2 = select_datas("Grupo 2 (Fenilmercurio2)")
# Preparacao da matriz (Transposta: amostras nas linhas, variaveis
nas colunas)
dataf = pd.concat([data1, data2], axis=1).T
# Execucao do PCA
pca = PCA(n_components=2)
pca_data = pca.fit_transform(dataf)
# Inverter sinal de PC1 para manter compatibilidade
pca_data[:, 0] = -pca_data[:, 0]
77
per_var = pca.explained_variance_ratio_ * 100
n1 = data1.shape[1] # Quantidade de amostras no grupo 1
# Plotagem
fig, ax = plt.subplots(figsize=(8, 6))
# Grupo 1 - Controle
g1_x = pca_data[:n1, 0]
g1_y = pca_data[:n1, 1]
ax.scatter(g1_x, g1_y, c=’black’, label=’Controle’)
draw_confidence_ellipse(g1_x, g1_y, ax, edgecolor=’black’,
linestyle=’--’, alpha=0.5)
# Grupo 2 - Fenilmercurio1
g2_x = pca_data[n1:, 0]
g2_y = pca_data[n1:, 1]
ax.scatter(g2_x, g2_y, c=’red’, label=’Fenilmercurio2’)
draw_confidence_ellipse(g2_x, g2_y, ax, edgecolor=’red’, linestyle
=’--’, alpha=0.5)
ax.set_xlabel(f’PC1 - {per_var[0]:.2f}%’)
ax.set_ylabel(f’PC2 - {per_var[1]:.2f}%’)
ax.legend()
ax.grid(True, linestyle=’:’, alpha=0.6)
plt.show()
# Loadings Plot PC1
plt.figure(figsize=(8, 4))
plt.plot(rs, -pca.components_[0], ’r’)
plt.xlabel(’Deslocamento Raman (cm$^{-1}$)’)
plt.ylabel(’PC1’)
plt.legend([’Loadings’])
plt.show()
# Loadings Plot PC2
plt.figure(figsize=(8, 4))
plt.plot(rs, pca.components_[1], ’blue’, label=’PC2’)
plt.xlabel(’Deslocamento Raman (cm$^{-1}$)’)
plt.ylabel(’PC2’)
plt.legend([’Loadings’])
plt.show()
MyPCA()
78
APÊNDICE B – Formalismo Quântico do Efeito Raman
No tratamento quântico, temos o dipolo elétrico de transição associada com uma transição
molecular de um estado inicial i para um final f , no qual foi induzido pelo campo elétrico incidente E. Utilizaremos o tratamento da teoria da perturbação, expressões do momento de dipolo
elétrico induzido de primeira, ordem pois é linear ao campo elétrico, e então a polarizabilidade
de transição αf i para o caso quântico (LONG, 2002).
Inicialmente, podemos escrever o momento de dipolo induzido total pf i como:
pf i = Ψ′f (t) p̂ Ψ′i (t) ,
(62)
onde p̂ é o operador momento de dipolo elétrico, ψf′ (t) e ψi′ (t) são as funções de onda pertubadas
dependentes do tempo nos estados final e inicial respectivamente. Podemos escrever a função de
onda perturbada dependente do tempo e do estado |r⟩ como sendo:
ψr′ (t) = ψr(0) (t) + ψr(1) (t) + ψr(2) (t) + ... + ψr(n) (t),
(63)
(0)
com ψr (t) representando o estado não perturbado.
Podemos escrever o Hamiltoniano de interação Ĥint entre o campo de radiação e a
molécula, responsável pela criação ou destruição de um fóton:
Ĥint = −p̂ · Ê,
(64)
sendo Ê o operador campo elétrico. Estamos considerando apenas essa interação de um dipolo. Já
o Hamiltoniano de radiação eletromagnética pode ser escrito como (SAKURAI; NAPOLITANO,
2013):
Ĥrad =
X
k
1
†
ℏωk ak ak +
.
2
(65)
Além disso, temos a energia interna da molécula (energias eletrônica, vibracional e rotacional)
Ĥmol . Portanto, podemos escrever o Hamiltoniano total do sistema como sendo:
Ĥtotal = Ĥmol + Ĥrad + Ĥint ,
(66)
com Ĥmol , Ĥrad
A função de onda inicial para um estado genérico |r⟩ pode ser expressa como:
(n)
ψi (t) =
X
(0)
a(n)
pir (t)ψr (t),
(67)
r
(n)
para o estado final é semelhante. Temos que o coeficiente apir (t) depende de Ĥint e do estado
|r⟩.
79
Ao substituir (62) na equação (63), tanto para o estado final f quanto para inicial i,
chegaremos na expressão do vetor total de dipolo elétrico induzido pela transição:
(0)
(1)
(2)
(n)
(p)f i = (p)f i + (p)f i + pf i + ... + pf i ,
(68)
uma vez que podemos escrever os termos de cada ordem:
D
E
(0)
(0)
(0)
(p)f i = Ψf (t) p̂ Ψi (t)
(1)
(p)f i =
D
E D
E
(0)
(1)
(1)
(0)
Ψf (t) p̂ Ψi (t) + Ψf (t) p̂ Ψi (t)
(69)
(2)
(p)f i =
D
(0)
(2)
Ψf p̂ Ψi
E
D
(2)
(0)
+ Ψf p̂ Ψi
E
D
(1)
(1)
+ Ψf p̂ Ψi
E
,
...
(0)
o termo (p)f i não depende de E, pois envolve somente funções de ondas não perturbadas, ou
seja, essa transição não está relacionada à dispersão da luz e não precisa ser considera.
Para nosso tratamento, consideramos que o espalhamento Raman possui apenas o termo
de primeira ordem do momento de dipolo, a pertubação na molécula causada por uma onda
eletromagnética plana monocromático de frequência ν0 = 2πω0 . Em posse do momento de
dipolo elétrico de transição de primeira ordem em (69), vamos obter as funções de ondas
perturbadas em termos das não perturbadas do sistema.
Com isso em mente, vamos reescrever as funções de ondas em notação de dirac:
E X
(1)
ψi (t) =
apir (t) ψr(0) (t) ,
(70)
r
enquanto que o transposto complexo conjugado para o estado final é:
D
X
(1)
ψf (t) =
a∗pf r (t) ψr(0) (t) ,
(71)
r
onde os coeficientes apir (t) e a∗pf r (t) (o complexo conjugado) são:
Z
E
i t ′ D (0)
(0)
dt
ψ
(t)
Ĥ
ψ
(t)
,
a
(t)
=
−
int
pir
r
i
ℏ 0
Z
E
i t ′ D (0)
∗
(0)
ap (t) =
dt ψf (t) Ĥint ψr (t) .
fr
ℏ 0
(72)
Com i sendo a unidade imaginária e ℏ a constante reduzida de Planck. Ao utilizar as equações
(70), (71) e (72), teremos o momento de primeira ordem:
ED
E
X i Z t D
(1)
(0)
(0)
(p)f i = −
ψf (t) p̂ ψr(0) (t)
dt′ ψr(0) (t) Ĥint ψi (t)
ℏ 0
r
ED
E
X i Z t D (0)
(0)
dt′ ψf (t) Ĥint ψr(0) (t)
ψr(0) (t) p̂ ψi (t) .
+
ℏ 0
r
(73)
80
Vale destacar que, semelhante a parte clássica em (5), podemos formular o momento de primeira
ordem para o espalhamento Rayleigh como sendo:
(1)
p0 (ω0 ) ii = (α)ii · E0 (ω0 ),
(74)
e no caso do espalhamento Raman:
p(1) (ω0 ± ωvib ) f i = (α)f i · E0 (ω0 ),
(75)
onde ωvib é a frequência angular de vibração, (α)ii e (α)f i são os tensores de polarizabilidade
de transição para os casos Rayleigh e Raman respectivamente. Nos próximos passos, vamos
determinar esses tensores.
Ao substituir o Hamiltoniano de interação de (64) em (73), considerando a componente
ρ que representa a direção em relação ao momento de dipolo induzido e a componente σ,
caracterizando a direção da polarização do campo elétrico incidente:
E D
E
X i Z t D
(0) ′
(0) ′
′
(0) ′
(1)
′
(t
)
dt
Ψ
(t
)
p̂
Ψ
(t
)
pρ f i = −
Ψ(0)
(t
)
−p̂
Ê
Ψ
ρ
σ
σ0
r
r
i
f
ℏ 0
r
E
E D
X i Z t D (0)
(0) ′
′
′
(0) ′
+
(t
)
.
Ψf (t′ ) −p̂σ Êσ0 Ψ(0)
(t
)
dt
Ψ
(t
)
p̂
Ψ
ρ
r
r
i
ℏ
0
r
(76)
Podemos expressar o campo elétrico da perturbação de forma clássica:
Eσ0 =
i
1h
Ẽσ0 e−iω0 t + Ẽ∗σ0 eiω0 t
2
(77)
sendo Ẽσ0 a amplitude complexa do campo. A partir desse momento faremos uma abordagem
semiclássica, considerando o campo elétrico como uma onda plana harmônica. Além disso,
como as funções de ondas presentes em (76) dependem do tempo, precismos escreve-las de
forma explícita, utilizando a evolução temporal de Schrödinger:
ψr(0) (t) = ψr(0) e−i(ωr −iΓr )t ,
(78)
o termo Γr está conectado com a largura do nível virtual r que possui tempo de vida finito, pois
é transitório. Já para os estados inicial e final, o tempo é infinito, ou seja, Γi = Γf = 0.
Agora, vamos resolver substituindo os termos, ao considerar que a parte real é a soma do
81
complexo com seu complexo conjugado, então:
Z t D
E
i X
′
(0)
(1)
(p)ρ f i = −
ψr(0) −p̂σ ψi
Ẽσ0 e−i(ω0 +ωi −ωr −iΓr )t dt′
2ℏ r̸=i
0
D
E
(0)
(0)
ψf p̂ρ ψr ei(ωf −ωr +iΓr )t
Z tD
E
D
E
(0)
(0)
i(ωf −ωr +iΓr )t
(0)
∗ i(ω0 −ωi +ωr +iΓr )t′ ′
(0)
dt ψf p̂ρ ψr e
ψr −p̂σ ψi
Ẽσ0 e
+
0
Z t D
E
i X
′
(0)
(0)
+
ψf −p̂σ ψr Ẽσ0 ei(−ω0 +ωf −ωr +iΓr )t dt′
2ℏ r̸=f
0
E
D
(0)
ei(−ωi +ωr +iΓr )t
ψr(0) p̂ρ ψi
Z tD
E
E
D
(0)
(0)
i(−ωi +ωr +iΓr )t
(0)
(0)
∗ i(ω0 +ωf −ωr +iΓr )t′ ′
e
ψf −p̂σ ψr Ẽσ0 e
dt ψr p̂ρ ψi
+
0
+ complexo conjugado,
(79)
resolvendo as integrais e rearrumando os termos, chegaremos:
1
p(1)
=
ρ
fi
2ℏ
X ⟨ψr |p̂σ |ψi ⟩ ⟨ψf |p̂ρ |ψr ⟩
r̸=i
ωri − ω0 − iΓr
Ẽσ0 e−i(ω0 −ωf i )t
⟨ψr |p̂σ |ψi ⟩ ⟨ψf |p̂ρ |ψr ⟩ ∗ i(ω0 +ωf i )t
Ẽσ0 e
+
ωri + ω0 + iΓr
1 X ⟨ψf |p̂σ |ψr ⟩ ⟨ψr |p̂ρ |ψi ⟩
Ẽσ0 e−i(ω0 −ωf i )t
+
2ℏ r̸=f
ωrf + ω0 + iΓr
⟨ψf |p̂σ |ψr ⟩ ⟨ψr |p̂ρ |ψi ⟩ ∗ i(ω0 +ωf i )t
Ẽσ0 e
+
ωrf − ω0 − iΓr
+ complexo conjugado.
(80)
Percebe-se que os sinais de iΓr nos denominadores da primeira parcela e terceira estão
trocados em (80), pois estamos levando em conta uma convenção, na qual está de acordo com a
fórmula citada por Placzek (1934) em seu tratamento clássico da dispersão Rayleigh e Raman,
pois alguns estudiosos mostraram que a convenção de sinais iguais produziriam resultados não
físicos e que esta convenção que estamos usando é correta para susceptibilidades e, portanto,
para polarizabilidades de todas as ordens (LONG, 2002).
Vale ressaltar que utilizamos as notações duplas nas frequências da seguinte forma:
ωf i = ωf − ωi ,
(81)
Er = ℏωr .
(82)
ademais, a energia no estado |r⟩ é:
82
Os termos das frequências presentes nas exponenciais em (80) nos revela que para (ω0 −ωf i ) > 0,
temos que o termo (ω0 − ωf i ) está ligado com a geração de espalhamento Rayleigh e Raman.
Para ωf i = 0, os estados iniciais e finais possuem a mesma energia, temos o espalhamento
Rayleigh. Caso ωf i < 0, temos o espalhamento anti-Stokes que é caracterizado pelo energia
do estado final ser mais baixa que do estado inicial. Enquanto que ωf i > 0 está relacionada ao
espalhamento Raman Stokes, cuja energia do estado final é maior que o inicial. Por outro lado,
o termo (ω0 + ωf i ) refere-se a emissão induzida de dois quanta, que não será considerado nos
nossos cálculos.
Portanto, ao desconsiderar os termos (ω0 + ωf i ), teremos:
1 X ⟨ψr |p̂σ |ψi ⟩ ⟨ψf |p̂ρ |ψr ⟩
⟨ψf |p̂σ |ψr ⟩ ⟨ψr |p̂ρ |ψi ⟩
(1)
+
pρ f i =
Ẽσ0 e−i(ω0 −ωf i )t
2ℏ r̸=i,f
ωri − ω0 − iΓr
ωrf + ω0 + iΓr
+ complexo conjugado,
nota-se que através de (83), a polarizabilidade geral nas componentes ρ e σ é:
⟨ψf |p̂σ |ψr ⟩ ⟨ψr |p̂ρ |ψi ⟩
1 X ⟨ψr |p̂σ |ψi ⟩ ⟨ψf |p̂ρ |ψr ⟩
+
,
αρσ f i =
ℏ r̸=i,f
ωri − ω0 − iΓr
ωrf + ω0 + iΓr
(83)
(84)
podemos simplificar a equação (84) considerando que o estado intermediário virtual é não
populado, ou seja, o termo iΓr é desprezível frente ao desvio de energia. Logo, redefinindo a
polarizabilidade de transição:
1 X ⟨ψr |p̂σ |ψi ⟩ ⟨ψf |p̂ρ |ψr ⟩
⟨ψf |p̂σ |ψr ⟩ ⟨ψr |p̂ρ |ψi ⟩
αρσ f i =
+
.
ℏ r̸=i,f
ωri − ω0
ωrf + ω0
(85)
Agora podemos escrever o momento de dipolo elétrico de transição induzido real:
1
−i(ω0 −ωf i )t
∗
i(ω0 −ωf i )t
p(1)
α
Ẽ
(ω
)e
+
Ẽ
(ω
)e
,
=
ρσ
σ0
0
0
ρ
σ0
fi
fi
2
(86)
∗
ao dizer que as amplitudes Ẽσ0 (ω0 ) = Ẽσ0
(ω0 ), chegaremos numa equação semelhante a parte
clássica de (13), então:
p(1)
=
α
Ẽ (ω0 ) cos[(ω0 − ωf i )t],
ρσ
ρ
fi
f i σ0
(87)
percebemos as similaridades com a parte clássica, onde (87) possui a mesma forma de campo
elétrico de (13), mas com dipolo elétrico de transição e polarizabilidade distintos.
83
APÊNDICE C – Introdução a acustofluídica
De forma geral, a matéria se encontra como sólida ou fluida, onde nosso foco será nesta,
que é usada para designar um gás ou líquido. Em se tratando de sólidos e fluidos clássicos, estes
seguem as conservações de massa, momento e energia. Para nosso trabalho vamos considerar
que estamos diante de um fluido ideal, ou seja, as propriedades macroscópicas como massa,
volume e pressão são constantes (Leão Neto, 2015).
Ao decorrer do texto usaremos com certa frequência o teorema da divergência de Gauss
para um campo vetorial C dado por (ARFKEN et al., 2007):
ZZ
ZZZ
C · dA =
(∇ · C)dV,
A
(88)
V
com A sendo a superfície onde se está integrando, no lado esquerdo, e V o volume onde está
integrando e (∇ · C) é o divergente de C.
Nessa seção, vamos abordar os alguns conceitos introdutório da Acústica: a conservações
da massa e do momento linear, além da equação de onda acústica em um fluído ideal.
C.0.1
Conservação da massa
Podemos expressar a densidade de um fluido ρf na posição r para um volume fixo V0 ,
com N moléculas em um instante t e mi a massa da partícula i:
N (t)
1 X
ρf (r, t) =
mi ,
V0 i=1
(89)
sendo a massa total M a contribuição de todas massas locais mi . Para cada elemento de massa,
temos uma velocidade da i-ésimo molécula dada por vi , no qual a velocidade do elemento do
fluido, ou ainda a velocidade de convecção, é dada por:
N (t)
X
1
v(r, t) =
mi vi .
ρf (r, t)V0 i=1
(90)
Em se tratando de um fluido isolado, a massa total somente poderá variar em decorrência
do fluxo de massa, visto que a massa não pode ser destruída nem criada devido a conservação
desta. Definamos então o fluxo de massa como sendo ϕmassa = ρf (r, t)v(r, t) através da
superfície A0 e do volume V0 . Portanto, ao ajustar a equação (89) e tomar a integral:
ρf (r, t)V0 =
N (t)
X
i=1
ZZZ
mi =⇒ M =
ρf (r, t)dV,
V
(91)
84
que ao fazermos a derivação temporal, nos leva:
ZZZ
∂M
∂ρf (r, t)
=
dV,
∂t
∂t
V0
lembrando que o fluxo de massa ϕmassa pode ser escrito como:
ZZ
ρf (r, t)v(r, t) · dA,
ϕmassa = −
(92)
(93)
A0
igualando as equações (92) com (93), temos:
ZZZ
ZZ
∂ρf (r, t)
dV = −
ρf (r, t)v(r, t) · dA,
∂t
V0
A0
utilizando o teorema do divergente (88) no lado direito de (94), teremos:
ZZZ
ZZZ
∂ρf (r, t)
dV = −
∇ · (ρf (r, t)v(r, t))dV.
∂t
V0
V0
(94)
(95)
Logo, ao igualar os integrandos, a equação da conservação das massas será então:
∂ρf
+ ∇ · (ρf v) = 0.
∂t
C.0.2
(96)
Conservação do momento linear
O momento linear P em um volume fixo V0 é o total dos momentos de cada molécula,
ou seja, com a equação (90) ao multiplicar por V0 ρf (r, t), teremos:
P = V0 ρf (r, t)v(r, t) =
N (t)
X
mi vi ,
(97)
i=1
para analisar as forças envolvidas, vamos calcular a taxa de variação temporal do momento,
tomando o limite para virar uma integral, chegaremos:
ZZZ
∂P
∂
=
ρf (r, t)v(r, t)dV.
∂t
∂t
V0
Aplicando a derivada no integrando, ao usar a regra do produto, temos:
ZZZ
∂P
∂ρf (r, t)
∂v(r, t)
=
v(r, t)
+ ρf (r, t)
dV.
∂t
∂t
∂t
V0
(98)
(99)
considerando que a Segunda Lei de Newton nos dá a força resultante, temos que (99) precisa
incluir as forças volumétricas, como gravitacional e eletromagnética, das superficiais exercidas
pelo ambiente sobre cada elemento do fluido e o fluxo do momento, definido por ρf vv (PIERCE,
1981). Portanto, teremos:
ZZZ
ZZ
ZZ
ZZZ
∂
ρf (r, t)v(r, t)dV +
ppre dA +
ρf vv · dA +
fV dV = 0.
∂t
V0
A0
A0
V0
(100)
85
onde ppres (r, t) é a pressão na posição r, vv é um tensor de segunda ordem e fV é a densidade
de força volumétrica. As duas integrais do meio podem ser escritas em termos de integrais
volumétricas em V0 , ao usar (88) e o teorema para tensores que é semelhante, vamos obter:
ZZZ
ZZZ
ZZZ
ZZZ
∂
ρf (r, t)v(r, t)dV +
∇ppre dV +
∇ · (ρf vv)dV +
fV dV = 0,
∂t
V0
V0
V0
V0
(101)
consequentemente, a equação parcial de conversação:
∂
ρf (r, t)v(r, t) + ∇ppre + ∇ · (ρf vv) + fV = 0.
∂t
(102)
Embora a gravidade, um exemplo de força volumétrica, esteja sempre presente em nosso
cotidiano, sua influência se torna desprezível nos fenômenos acústicos, exceto para frequências
extremamente baixas, por isso iremos desconsiderá-la (PIERCE, 1981). Com isso, definindo um
tensor de tensões para um fluido não-viscoso S = ppres I + ρf vv, no qual o gradiente de pressão
foi reescrito como ∇ppres = ∇ · ppres I, sendo I o tensor unitário (Leão Neto, 2015). Logo, a
equação da conservação do momento será:
∂
ρf (r, t)v(r, t) + ∇ · S = 0.
∂t
(103)
Podemos reescreve-la de uma forma mais apropriada com intuito de utilizar mais adiante. Para
isso, considere a seguinte propriedade da regra do produto para o operador ∇ aplicado a um
tensor dual (ARFKEN et al., 2007):
∇ · ρf vv = (∇ · ρf v)v + ρf v · ∇,
substituindo a conservação da massa (96) em 104, temos:
∂ρf
∇ · ρf vv = −
v + ρf v · ∇v,
∂t
(104)
(105)
que ao substituí-la na conservação do momento (103) chegaremos em uma outra forma de
escrevê-la:
∂ρf
v
∂t
+ ρf
∂v
∂t
+ ∇ppres −
∂ρf
v + ρf v · ∇v = 0,
∂t
simplificando, nos leva para uma nova forma da conservação do momento:
∂
ρf
+ v · ∇ v + ∇ppres = 0.
∂t
(106)
(107)
86
C.0.3
Propagação de ondas acústicas em um fluido ideal
Para chegarmos na equação de onda que define a propagação da onda acústica, iremos
considerar um fluido homogêneo, com viscosidade nula, incompressível, ou seja, um fluido
ideal. O estado ambiente é caracterizado pelas grandezas (ppres0 , ρf0 , v0 ), pressão, densidade e
velocidade do fluido ambiente, respectivamente quando não há nenhuma pertubação. No entanto,
para perturbações de pequena amplitude em um estado ambiente podemos descrever distúrbios
acústicos (PIERCE, 1981). Então, em primeira ordem temos:
ppres = ppres0 + ppres1 ,
ρf = ρf0 + ρf1 ,
v = v0 + v1 ,
(108)
Expandindo a pressão em série de Taylor, em torno de ρf0 :
ppres − ppres0 =
∞
X
(ρf − ρf )n ∂ n ppres
0
n!
n=1
∂ρnf
,
(109)
ρf0
analisando a unidade da variação temporal da pressão de primeira ordem, percebemos que ela
possui dimensão de velocidade ao quadrado:
∂p
kg m s−2 m−2
=
= m2 s−2 ,
−3
∂ρ
kg m
então temos a velocidade do som, caracterizando assim ondas de pressão:
∂p
= c20 ,
∂ρ ρf
(110)
(111)
0
vale mencionar que ao utilizar a equação (109) para n = 1, termos de primeira ordem, e substituir
os valores apropriados das equações (108) além de usar (111), chegaremos:
ppres1 = c20 ρf1 .
(112)
Podemos reescrever a equação da continuidade das massas (96) ao substituir as equações
de (108), considerando que fluido está em repouso v0 = 0 e simplificando os outros termos que
não seja de primeira ordem, teremos:
∂ρf0 ∂ρf1
+
+ ∇ · (ρf0 v1 ) + ∇ · (ρf1 v1 ) = 0.
∂t
∂t
(113)
note que a primeira derivada de 113 é nula, já que ρf0 é constante. Ademais, o produto de
duas quantidades de primeira ordem é de segunda ordem, portanto, o termo ∇ · (ρf1 v1 ) será
87
desconsiderado, uma vez que estamos considerando a dinâmica linear. Então, ao reescrever a
equação (113) considerando (112) para escreve em termos da pressão, vamos obter:
1 ∂ppres1
+ ∇ · (ρf0 v1 ) = 0.
c20 ∂t
(114)
Vamos agora para a conservação do momento (107), em posse das equações de (108)
novamente considerando fluido em repouso:
∂
(ρf0 + ρf1 )
+ v1 · ∇ v1 + ∇(ppres0 + ppres1 ) = 0,
∂t
(115)
o termo ∇ppres0 é zero, pois ppres0 é constante e como vimos antes, os produtos de primeira
ordem são desprezíveis. Simplificando, chegaremos:
∂v1
ρ f0
+ ∇ppres1 = 0,
∂t
(116)
as equações (114) e (116) são as equações lineares da dinâmica dos fluidos.
Com intuito de determinar a equação de onda, temos que tomar o rotacional de (116):
∂v1
ρf0 ∇ ×
+ ∇ × ∇ppres1 = 0,
(117)
∂t
percebe-se que a velocidade do elemento do fluido é irrotacional, uma vez que o segundo termo
de (117) é nulo devido ao fato que o rotacional de um gradiente é sempre nulo (ARFKEN et al.,
2007), e com isso, podemos expressar a velocidade v1 através de uma função escalar Φ(r, t), ou
seja:
v1 = ∇Φ(r, t).
(118)
A pressão pode ser escrita usando o potencial de velocidade por meio de (116):
ppres1 = −ρf0
∂Φ
,
∂t
(119)
em posse de (118) e (119), ao serem substituídas em (114) teremos enfim a equação linear da
onda para o potencial de velocidade:
1 ∂2
∇ − 2 2 Φ = 0.
c0 ∂t
2
(120)
Além disso, podemos escrever a equação linear da onda de uma outra forma, ao levar
em conta que os fenômenos nos quais envolvem a força de radiação acústica estão ligados
com campos acústicos de pressão, densidade e velocidade que contenham variação temporal
harmônica cuja frequência angular é dada por ω = 2πf , com f sendo a frequência da onda
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acústica e com isso, a velocidade do elemento do fluido é regido por Φ(r)e−iωt (Leão Neto,
2015). Portanto, a equação de Helmholtz é:
∇2 + k 2 Φ(r) = 0,
(121)
com k sendo o número de onda, ∇2 o laplaciano e Φ(r) a amplitude a ser determinada por
intermédio das condições de contorno do problema.